论文总字数：15933字

摘 要

为了提高里氏木霉纤维素酶中β-葡萄糖苷酶的活性，从而更好地降解纤维素，根据根癌农杆菌介导里氏木霉转化方法的突出优点，构建更好的农杆菌转化体系，获得活性更高、转化率更好的转化子，本实验通过观察在不同浓度梯度CaCl₂溶液下根癌农杆菌EHA105的感受态细胞的制备情况，筛选出最合适的钙离子的浓度。在转化过程中，观察不同热激温度下农杆菌的转化状态，以确定出最合适的转化温度以便后续完成对里氏木霉的转化。通过最终对平板上的阳性转化子个数进行分析，得到外源质粒DNA转化进入农杆菌EHA105时的最佳转化条件。结果表明，根癌农杆菌EHA105活性最强为OD₆₀₀=0.8~1.3时，这一时期又被称为对数生长期，采用此时期的农杆菌获得的转化效率较高；在处理感受态细胞时，为了使感受态细胞处于最佳状态，CaCl₂溶液浓度在8 mmol·L^-1为宜，此时农杆菌的转化率达4.12×10⁶·μg^-1。在转化时，为了获得最高的转化效率（5.76×10⁶·μg^-1），热激处理温度20-37℃之间效果最好，在筛选出农杆菌转化里氏木霉最好的条件之后，后续实验中将利用已经构建好的农杆菌转化子完成对里氏木霉的最终转化，从而提高纤维素酶的活性。

关键词：农杆菌，感受态细胞，转化，Cel3d

Abstract：In order to improve the β-glucosidase activity in the cellulase of Trichoderma reesei, thereby better degrading cellulose, a better transformation of Agrobacterium was constructed based on the outstanding advantages of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Trichoderma reesei System, to obtain a higher activity, better conversion rate of the transformants, this experiment by observing different concentrations of CaCl₂ solution in different concentrations of competent cells of Agrobacterium tumefaciens EHA105 preparation, screening out the most appropriate concentration of calcium ions. During the transformation process, the state of transformation of Agrobacterium at different heat shock temperatures was observed to determine the most suitable transformation temperature for the subsequent completion of the transformation of T. reesei. By finally analyzing the number of positive transformants on the plate, the optimal transformation conditions for transforming the foreign plasmid DNA into Agrobacterium EHA105 were obtained. The results showed that the highest activity of Agrobacterium tumefaciens EHA105 was OD600=0.8-1.3, which was also referred to as the logarithmic growth phase. The transformation efficiency was higher when Agrobacterium tumefaciens was used in this period; when the competent cells were processed In order to make the competent cells in the best state, the optimal concentration of CaCl₂ solution is 8 mmol·L^-1. At this time, the conversion rate of Agrobacterium reaches 4.12×10⁶·μg^-1. In order to obtain the highest conversion efficiency (5.76×10⁶·μg^-1) during transformation, the best heat shock treatment temperature is between 20-37°C. After selecting the best conditions for Agrobacterium tumefaciens transformation, Subsequent experiments will use the already constructed Agrobacterium transformants to complete the final transformation of T. reesei, thereby increasing cellulase activity.

Keywords: Agrobacterium, Competent cells, Transformation, Cel3d

目 录

1 前言 6

1.1 实验背景 6

2 农杆菌感受态细胞的制备原理 7

3 实验内容 7

4 实验材料与实验方法 8

4.1实验材料 8

4.1.1 实验材料 8

4.1.2　实验试剂 8

4.1.3　实验仪器 8

4.1.4　培养基 8

4.2 方法 8

4.2.1 测定农杆菌EHA105的生长状态 8

4.2.2 农杆菌感受态的制备和转化 9

4.2.3 农杆菌感受态制备时不同浓度CaCl₂的优化 9

4.2.4农杆菌转化时热激温度的优化 9

4.2.5 Pact-Cel3d-pCAMBIA1300质粒的碱基序列及基因分布 10

4.2.6 转化子的计算和PCR扩增条件 11

4.2.6.1 转化频率计算 11

4.2.6.2 PCR扩增条件 11

5 结果与分析 11

5.1 绘制农杆菌EHA105的生长曲线 11

5.2 CaCl₂浓度对农杆菌感受态制备的影响 12

5.3 农杆菌EHA105转化质粒时热激温度的影响 14

6 通过Pact-Cel3d-pCAMBIA1300质粒转化农杆菌 16

7 讨论 17

致 谢 20

1 前言

1.1 实验背景

纤维素是目前地球上储备量最丰富的可再生资源。由于目前对其利用率极低，纤维素存在于自然界不易被降解，所以对于纤维素的开发和利用具有十分重要的研究意义。实际生活中，对纤维素的降解最有效的方法是利用纤维素酶，而在工业生产上，里氏木霉是生产纤维素产量最高的菌株。

里氏木霉产纤维素酶主要分为内切葡萄糖苷酶，外切葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶三种。其中，由于β-葡萄糖苷酶可以水解纤维素中的β-1,4-糖苷键使纤维二糖最终变成小分子的葡萄糖，从而被微生物加以利用。但是由于β-葡萄糖苷酶含量较少并且酶活较低，所以一直成为研究的重点。

本实验采用农杆菌介导的转化法完成对里氏木霉的转化，从而提高纤维素酶的活性。

植物遗传转化技术（Plant genetic transformation）是一种基本的DNA重组技术。其原理是通过基因工程的方法，将外源质粒进行定向改造，并且通过一系列的方法将外源质粒导入到受体细胞中，从而实现稳定的遗传和表达^[1]。在实验室中最常用的方法是基因枪法和农杆菌转化法，其中基因枪法是通过将金属离子附着在外源DNA上，在高压装置中实现加速从而快速进入到受体细胞完成转化的一门技术^[2]。但是基因枪法自身存在着许多的弊端，如：转化效率较低，外源DNA整合机理不明确、得到的转化子遗传稳定性较低、转化的DNA沉默等等^[3]。

在转化实验中，农杆菌中的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacien）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogene）都可以诱导植物受体完成转化。其中，根癌农杆菌自身携带的Ri质粒能在侵染植物细胞时诱发受体受伤部位病变，产生冠瘿瘤；发根农杆菌自身携带的Ti质粒能在侵染植物细胞时诱发受体受伤部位病变，产生毛发状根。农杆菌中携带有转运DNA（Transfer DNA，又称T-DNA），转运DNA本身携带有一段vir基因可以在农杆菌与受体细胞结合时将基因转入受体细胞^[4]，从而实现转化。

1985年，HORSCH等科学家利用农杆菌完成了对烟草叶盘介导的转化，这一成果使得农杆菌介导的转化技术日趋成熟^[3]。在技术上，玉米^[5]、棉花等^[6]都完成了用农杆菌介导使之定向遗传和表达的过程。在真菌中，也多用农杆菌完成对受体细胞的定向改造。丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）因为其本身具有分泌纤维素酶和半纤维素酶的能力^[7]，所以成为目前在工业上生产纤维素酶的主要菌株。实验的最终目的是通过转化完成的农杆菌侵染里氏木霉，完成对里氏木霉的转化从而获得高产纤维素酶的霉菌菌株。利用农杆菌介导完成的转化，获得的转化子产酶量和表达效率都比较高。

在转化的过程中，将含有目的基因的质粒导入到农杆菌中是第一个关键步骤。

在操作中，存在许多物理、化学和生物的方法可以将外源DNA导入农杆菌中。例如：三亲杂交法，由于需要三种细菌才能将重组质粒转化进入农杆菌，故其操作十分的复杂和繁琐，以及耗时较长^[8]；电激转化法则需要昂贵的实验器材以及严苛的转化环境^[8]；相比之下，冻融法操作简单，不需要特殊的转化器材，因此在实际应用中倍受青睐。

为了更好地在后续实验中完成对里氏木霉的转化，本实验从农杆菌自身生长状态入手，通过设置不同的条件（如温度、溶液浓度等），确定其最佳优化条件，从而获得长势良好、活性较高的农杆菌菌株。

2 农杆菌感受态细胞的制备原理

在植物基因工程中，完成根癌农杆菌感受态的制备是基础，是实现由农杆菌介导的转化的前提^[9]，之后，若要更好的完成对里氏木霉的转化，感受态细胞制备的效果则是重中之重。综合考虑各类方法的优缺点，目前实验室通常采用的感受态细胞的制备方法是冻融法^[10]。

冻融法实验操作相对简单，成功率高、遗传效果好，可广泛应用于一般的实验室^[11]。在冻融法的操作中，常常使用低温（0℃）处理过的CaCl₂溶液来处理农杆菌，使其处于感受态，在钙离子的作用下农杆菌细胞膜内的磷脂双分子层会形成液晶结构，此时细胞的状态呈球形，在这种状态下，存在于细胞外膜与内膜之间的一些核酸酶会发生解离，从而改变了细胞本身的渗透压，从而影响了细胞自身的通透性，此时外源质粒DNA极易在细胞表面附着并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物^[12]。

3 实验内容

在转化过程中，CaCl₂的浓度、感受态细胞的质量、转化时的热激温度、农杆菌自身的生产状态等等^[13]都会在一定程度上影响农杆菌的转化效率。本实验以农杆菌EHA105为受体细胞，通过设置不同钙离子的浓度、转化时的热激温度使农杆菌处于不同的感受态，然后通过实验室现存的pUC18质粒进行转化，分析不同条件下对农杆菌EHA105转化效率的影响，从而筛选出最适合转化的最优条件，在最佳条件下转化已构建的Pact-Cel3d-pCAMBIA1300的质粒，旨在为后期对通过农杆菌介导里氏木霉的转化提供最佳的实验依据。

4 实验材料与实验方法

4.1实验材料

4.1.1 实验材料

农杆菌EHA105, 卡那霉素抗性。质粒Pact-Cel3d-pCAMBIA1300, 卡那霉素、利福平和链霉素抗性，质粒pUC18。

4.1.2　实验试剂

NaCl、CaCl₂、MgSO₄、蔗糖、牛肉浸膏，均为分析纯；利福平(Rif)：浓度2.5μg/ml，链霉素(Sm)：浓度50μg/ml，卡那霉素(Kan)：浓度50μg/ml；胰蛋白胨、酵母粉、酵母浸粉。

4.1.3　实验仪器

台式离心机, 全温振荡培养箱, V-6000PC型紫外可见分光光度计, 电泳仪DYY-6C, WD -9403B 型紫外分析仪, PCR 仪。

4.1.4　培养基

LB 培养基:1 %胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1 % NaCl，蒸馏水配制。

YEB培养基：牛肉浸膏5%，酵母浸膏1%，蛋白胨5%，蔗糖5%，MgSO₄·H₂O 0.5g/L，调至pH=7。

4.2 方法

4.2.1 测定农杆菌EHA105的生长状态

取-70℃冰箱保存的农杆菌EHA105菌在含有2.5μg/ml的利福平和50μg/ml的链霉素的固体LB平板上划线接种，放在28℃的培养箱里培养36-48h，观察是否有单菌落产生。之后挑取单个菌落在5ml的LB 液体培养基中，在温度为28℃、转速200rpm过夜培养。测得吸光度值OD₆₀₀=0.5（所需时间大约8小时），并制备感受态细胞。

4.2.2 农杆菌感受态的制备和转化

将上述菌液（液体YEB中的农杆菌）在4℃下冰浴30min，转移进离心管中，8000rpm离心5min收集菌体，用不同浓度下的 CaCl₂洗重悬细胞（重悬时要轻）。4℃，8000rpm离心5分钟再次收集菌体，弃上清液，用 CaCl₂重浮菌体时，重悬细胞一定要轻，加入无菌甘油至终浓度为15-20%，放入液氮中速冻后分装进入小型离心管（每份200μL）在-80℃冰箱保存。
在冰上融化农杆菌的感受态。在感受态细胞中加入1μL质粒，将二者混匀，在冰上放置30min，然后转移至液氮中放置5min，在不同温度梯度下热激5min，转移至冰上放置5min。将1ml液体 LB培养基加入离心管中，然后放入摇床，设置温度28℃、转速200rpm下培养2-3h。5000rpm 离心3min，去掉800μL上清，重悬后吸取100μL，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板上，28℃黑暗条件下培养2-3天。 

4.2.3 农杆菌感受态制备时不同浓度CaCl₂的优化

本实验采用冻融法来制备农杆菌EHA105的感受态细胞。在利用CaCl₂重悬细胞沉淀时，设置不同的浓度梯度。实验过程中设置了不同浓的CaCl₂溶液共8个梯度，分别是：0、2、4、6、8、10、20、40mmol·L^-1，每个梯度设置3次重复，不同钙离子处理状态下的农杆菌细胞（100μL）分别加入等量的pUC18质粒DNA（1μL）混匀，之后在每个混匀的离心管中加入1ml不含任何抗生素的液体LB培养基，最后取100μL涂布于含有卡那霉素（工作浓度50μg/ml）抗性的平板上，观察并记录农杆菌菌落的个数。大约2-3天后在抗性平板上挑选5-10个单菌落接种到液体LB培养基中，在上述条件下过夜培养。

4.2.4农杆菌转化时热激温度的优化

在10 mmol·L^-1氯化钙溶液处理下的农杆菌感受态细胞（每管200μL）分别加入等量的pUC18质粒DNA（1μL），经过液氮速冻处理后，再在设置的不同温度梯度下热激5min。本实验设8个不同的温度梯度，分别是：0、10、20、30、37、45、50、60℃，每个温度下重复3次，最后取10μL转化液涂在含有卡那霉素抗性的平板上观察转化子的生长情况。2-3天后挑选单菌落接种在液体的LB培养基中，以菌落为模板，进行PCR扩增。条件如下（表1）所示。PCR结束后将其产物进行琼脂糖凝胶电泳，进一步鉴定转化子是否为阳性。

4.2.5 Pact-Cel3d-pCAMBIA1300质粒的碱基序列及基因分布

pCAMBIA1300质粒图谱如图1所示，整个质粒大小为9859bp。β-葡萄糖苷酶Cel3d的基因序列为：

atgattctcggctgtgaaagcacaggtgtcatctctgccgtcaaacactttgtcgccaacgaccaggagcacgagcggcgagcggtcgactgtctcatcacccagcgggctctccgggaggtctatctgcgacccttccagatcgtagcccgagatgcaaggcccggcgcattgatgacatcctacaacaaggtcaatggcaagcacgtcgctgacagcgccgagttccttcagggcattctccggactgagtggaattgggatcctctcattgtcagcgactggtacggcacctacaccactattgatgccatcaaagccggccttgatctcgagatgccgggcgtttcacgatatcgcggcaaatacatcgagtctgctctgcaggcccgtttgctgaagcagtccactatcgatgagcgcgctcgccgcgtgctcaggttcgcccagaaggccagccatctcaaggtctccgaggtagagcaaggccgtgacttcccagaggatcgcgtcctcaaccgtcagatctgcggcagcagcattgtcctactgaagaatgagaactccatcttacctctccccaagtccgtcaagaaggtcgcccttgttggatcccacgtgcgtctaccggctatctcgggaggaggcagcgcctctcttgtcccttactatgccatatctctatacgatgccgtctctgaggtactagccggtgccacgatcacgcacgaggtcggtgcctatgcccaccaaatgctgcccgtcatcgacgcaatgatcagcaacgccgtaatccacttctacaacgaccccatcgatgtcaaagacagaaagctccttggcagtgagaacgtatcgtcgacatcgttccagctcatggattacaacaacatcccaacgctcaacaaggccatgttctggggtactctcgtgggcgagtttatccctaccgccacgggaatttgggaatttggcctcagtgtctttggcactgccgacctttatattgataatgagctcgtgattgaaaatacaacacatcagacgcgtggtaccgcctttttcggaaagggaacgacggaaaaagtcgctaccaggaggatggtggccggcagcacctacaagctgcgtctcgagtttgggtctgccaacacgaccaagatggagacgaccggtgttgtcaactttggcggcggtgccgtacacctgggtgcctgtctcaaggtcgacccacaggagatgattgcgcgggccgtcaaggccgcagccgatgccgactacaccatcatctgcacgggactcagcggcgagtgggagtctgagggttttgaccggcctcacatggacctgccccctggtgtggacaccatgatctcgcaagttcttgacgccgctcccaatgctgtagtcgtcaaccagtcaggcaccccagtgacaatgagctgggctcataaagcaaaggccattgtgcaggcttggtatggtggtaacgagacaggccacggaatctccgatgtgctctttggcaacgtcaacccgtcggggaaactctccctatcgtggccagtcgatgtgaagcacaacccagcatatctcaactacgccagcgttggtggacgggtcttgtatggcgaggatgtttacgttggctacaagttctacgacaaaacggagagggaggttctgtttccttttgggcatggcctgtcttacgctaccttcaagctcccagattctaccgtgaggacggtccccgaaaccttccacccggaccagcccacagtagccattgtcaagatcaagaacacgagcagtgtcccgggcgcccaggtcctgcagctatacatttcggccccaaactcgcctacacatcgcccggtcaaggagctgcacggattcgaaaaggtgtatcttgaagctggcgaggagaaggaggtacaaatacccattgaccagtacgctactagcttctgggacgagattgagagcatgtggaagagcgagaggggcatttatgatgtgcttgtaggattctcgagttag

β-葡萄糖苷酶Cel3d由actin的启动子驱动，Pact-Cel3d插在pCAMNIA1300质粒上Xbal-Ⅰ和HindⅢ位点之间。

图1 Pact- pCAMBIA1300基因分布

4.2.6 转化子的计算和PCR扩增条件

4.2.6.1 转化频率计算

转化子总数=菌落数×转化反应原液总体积×稀释倍数/涂板菌液体积^[14]

转化效率=转化子总数/ DNA加入量(μL)×100%.

4.2.6.2 PCR扩增条件

根据基因序列合成特异性引物，以菌液为模板进行PCR扩增，扩增体系为：ddH₂O 40.5μL、10×Buffer 5μL、dNTPs 1μL、Forward primer 1μL、Reverse primer 1μL、菌液1μL、Taq酶0.5μL共50μL体系。

扩增条件为：预变性（95℃）2min、变性（95℃）20s、退火（65℃）20s、延伸（72℃）15s、再延伸（72℃）5min。

5 结果与分析

5.1 绘制农杆菌EHA105的生长曲线

通过对农杆菌生长状态的观测，横坐标为时间，以吸光度（OD₆₀₀）为纵坐标（图2），绘制农杆菌EHA105的生长图。由图可知，农杆菌菌株在培养的2天内，吸光度值伴随着时间的增加变的越来越大。通过文献查阅可知，农杆菌的生长周期可以用适应期、对数期、稳定期、衰败期4个时期来概括^[14]。从图可知，在生长过程的0-8小时内为适应期，在这一时期，菌株在快速繁殖，但因为基数少，所以总量有限；在8-24小时内为对数期，经过前一时期对生长坏境的适应，农杆菌开始大量繁殖，并且因为前一时期的繁殖使菌株的数量增多，所以这一时期开始高速繁殖，并且可以看出，在第12-18小时内细菌繁殖速度最快；当培养到42小时，细菌增长出现停滞，生长曲线不再继续迅猛增长，从而进入稳定期，这是因为农杆菌在之前的时间段内的大量繁殖，导致数量成几何式增加，大量细菌的繁殖消耗了大量培养基中的营养成分，使其生长坏境发生了变化，从而新细菌的繁殖和老细胞的死亡出现了一定程度的平衡，因此，在第42-46小时内为生长曲线的稳定期；46小时后，由于环境中的营养成分的消失殆尽，细菌开始出现死亡，这一时期是细菌生长的衰败期，此时细菌开始出现“负增长”现象。在实验过程中发现，在培养14小时后，吸光度值OD₆₀₀=0.826；当培养16小时后，吸光度值OD₆₀₀=1.324，在两个小时内农杆菌长速迅猛，这是由于这一时期的农杆菌处于对数生长期，制备感受态时采用这一时期的细胞效果最好。所以，在实验操作时，应选取培养时间在14-16小时的细胞为最佳，也就是OD₆₀₀值在0.8-1.3之间，此时农杆菌生长状态最为旺盛。

图2 农杆菌的生长曲线

5.2 CaCl₂浓度对农杆菌感受态制备的影响

实验操作过程中，设置8个不同浓度梯度的CaCl₂溶液处理农杆菌的感受态细胞，在其他条件均不变的情况下，测定转化率。本实验采用0、2、4、6、8、10、20、40mmol·L^-1的CaCl₂溶液处理，得到的结果如表3所示。

表3 不同浓度下CaCl₂对农杆菌转化效率的影响

CaCl2/ mmol·L -1	0	2	4	6	8	10	20	40
转化子均值	1.3	3.23	4.23	20.4	68.67	30.3	6.4	1.56
标准差	0.017	0.208	0.251	2.517	3.215	3.512	2.309	0.351
转化效率（×106）	0.078	0.193	0.253	1.224	4.120	1.818	0.384	0.093

注：转化子均值为3次平均值。

表4 CaCl₂方差处理分析结果

转化效率
	平方和	df	均方	F	显著性
组间	11541.701	7	1629.880	377.251*	.000
组内	69.127	16	4.320
总数	11610.828	23

注：表中*表示差异极显著

从表4可以知，组间达到了极显著水平（F=377.251＞F_0.01(3.54)），说明用不同浓度的 CaCl₂溶液处理感受态细胞时得到的农杆菌的状态有着明显的差别，从而接受外源DNA的能力也就有明显的不同。对CaCl₂浓度通过Duncan法进行进一步的组间多重比较（表5）可以知道，钙离子浓度为6、8、10 mmol·L^-1时，与其他浓度相比达到了显著差异的水平，而氯化钙浓度为0、2、40 mmol·L^-1 3个组别之间；氯化钙浓度在2、4、40 mmol·L^-1之间；氯化钙浓度在2、4、20 mmol·L ^-1之间差异不显著。

表5 不同CaCl₂浓度组间多重比较结果

邓肯法比较结果
	CaCl2浓度	N	alpha = 0.05 的子集
			1	2	3	4	5	6
Duncana	0	3	.1500
	40	3	1.5667	1.5667
	2	3	3.2333	3.2333	3.2333
	4	3		4.2333	4.2333
	20	3			6.3333
	6	3				20.3333
	10	3					30.3333
	8	3						68.6667
	显著性		.101	.155	.102	1.000	1.000	1.000
将显示同类子集中的组均值。
a. 将使用调和均值样本大小 = 3.000。

图3 CaCl₂浓度对转化效率的影响

从图3可以看出，随着CaCl₂浓度的增加，转化效率的改变也十分明显，呈现出先上升后下降的变化趋势。用浓度为8 mmol·L^-1钙离子处理细胞获得的转化效率最高，为4.12×10⁶·μg^-1。当浓度在0-8mmol·L^-1这个区间内时，随着CaCl₂浓度的增加，转化的效率也逐渐提高，即二者呈现出正相关的关系，但也并不意味着CaCl₂浓度越高越好，当浓度处于8-40这个区间内时，随着浓度的增加，转化效率呈下降趋势，即负相关。从图3中还可以看出，浓度在0-40之间都可以使农杆菌处于感受态并且接受外源DNA。值得注意的是，当钙离子浓度为0 mmol·L^-1时，细胞仍能处于感受态并且吸收外源质粒，但是转化效果远远不如用CaCl₂处理之后。在浓度大于40mmol·L^-1时，其制备效果可能与纯水无异。所以，最佳处理农杆菌感受态的CaCl₂溶液浓度为8 mmol·L^-1。农杆菌EHA105制备感受态细胞在8个不同浓度梯度的钙离子处理后，完成质粒的转化（图4）。

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