蜡质芽孢杆菌 BS1对黄瓜霜霉病防治作用研究
2024-01-10 09:53:29
论文总字数：7409字
摘 要
：本课题旨在研究蜡质芽孢杆菌BS1对黄瓜的促生作用，并探讨其对黄瓜霜霉病的生防作用。本研究通过孢子萌发抑制率和致病性检验这两种方法来研究生防菌BS1对黄瓜霜霉病病原菌的作用机理。结果表明：蜡质芽孢杆菌BS1的上清液稀释2.5、5、10倍后对黄瓜霜霉病抑制率分别是91.7%、88.3%、86%，以及蜡质芽孢杆菌BS1的菌体浓度为5×108 CFU/mL时的孢子囊对黄瓜霜霉病抑制率为92.7%。关键词：黄瓜霜霉病，萌发抑制率，致病性检验，蜡质芽孢杆菌BS1
Abstract：This paper aims to study the role of growth-promoting Bacillus cereus BS1 cucumber and explore its effects on biocontrol of cucumber downy mildew. In this study, the rate of spore germination and pathogenicity test both methods to graduate bacteria BS1 mechanism of cucumber downy mildew pathogen. The results showed that: Bacillus cereus supernatant inhibition rate of cucumber downy mildew BS1 2.5, 5-fold dilution were 91.7%, 88.3%, 86%, and the concentration of Bacillus cereus cell BS1 to 5 × 108 CFU / mL when sporangia cucumber downy mildew inhibition was 92.7%.
Keywords: cucumber downy mildew, promoting growth, bacillus cereus BS1
目录
1 前言 4
2 材料与方法 5
2.1 供试菌株 5
2.2 培养基的选择 5
2.3 主要仪器的来源 5
2.4 试剂类型 5
2.5 生物菌的制备 6
2.5.1 霜霉病孢子囊悬浮液的制备 6
2.6 致病性测定 6
2.7 病原菌的鉴定 6
2.8 孢子囊萌发抑制率的测定 6
2.9 数据统计分析 7
3 结果与分析 7
3.1黄瓜霜霉病田间症状 7
3.2致病性测定结果 7
3.3病原菌鉴定结果 8
3.4 孢子囊萌发抑制率测定结果 9
讨论 9
参考文献 11
致 谢 12
1 前言
黄瓜(Cucums sativus L.)在植物分类学上属于葫芦科(Cucurbitaceae)、黄瓜属(Cucums)。黄瓜是我国重要的大众蔬菜作物之一。黄瓜种植过程中经常会发生黄瓜枯萎病,霜霉病,白粉病,灰霉病,黄瓜蔓枯病等病害[1-3]。黄瓜霜霉病[Phytophthora sojae．megasperma]俗称黑毛、跑马干，各地普遍发生，是危害黄瓜最严重的病害之一。该病原菌属于鞭毛菌亚门(Mastigomycotina)，假霜霉属(Pseudoperonospora)真菌。霜霉病发生快，流行迅速，苗期、成株均可发病，主要危害叶片，严重田减产10％～30％，局部田块可导致植株死亡率达50％以上[4-6]。大棚黄瓜霜霉病的发生和流行一般是由植株、菌源和环境条件共同作用的结果，环境条件起到决定作用[7]。霜霉病原菌在南方温暖地区可在田间发病植株上越冬，在北方寒冷地区可在温室生产的黄瓜植株上越冬。环境条件适宜（最适温度为15～24℃），孢子囊迅速萌发放出游动孢子，在叶片有水膜或水滴的条件下2个小时就完成侵入 [8,9]。
目前防治黄瓜霜霉病的方法主要有农业防治，化学防治以及生物防治[10-12]。农业防治常采用采用高温闷棚[7]、清除病残、使用抗病品种等措施，但高温条件对黄瓜的正常生长有影响，农事操作也耗时费力且效果不佳。化学防治虽然快速有效，但是容易产生农药残留，也容易造成霜霉病菌对药物的抗性。如黄瓜霜霉菌对甲霜灵的抗性于1979年首次报道[13]，目前发现黄瓜霜霉病菌对多种药剂存在抗药性或潜在抗药性[7]。生物农药具有生产原料来源广泛，对非靶标生物安全，毒副作用小，对环境兼容性好，对有害生物能够持续作用等优点，已成为全球农药产业发展的新趋势[14] 。
目前应用较多的生防菌主要有木霉( Trichoderma)、假单胞菌 ( Pseudomonas)，枯草芽孢杆菌（B.subtilis)等。本研究筛选出防治黄瓜霜霉病生防菌为肠杆菌属的细菌。肠杆菌(Enterobacter spp．)属细菌是一类革兰氏阴性、周生鞭毛、厌氧发酵型杆状细菌，是一种广泛存在于土壤、水、动植物和昆虫体内、及其周边环境的微生物阴沟肠杆菌E.cloacae(ATCCl3047)为该属的模式种[15]。肠杆菌可用于由疫霉、灰霉菌和镰刀菌引起的植物病害的生物防治。在作物根围能够产生嗜铁素、产生挥发性/不挥发性的抗菌物质以及对土壤固态磷酸盐的溶解，因此，也常被用于植物促生菌进行开发(VanTiel-Menkveld et a1.,1982；Mishra et a1.,2004)[15]。
2 材料与方法
2.1 供试菌株
菌株来源：由淮阴师范学院洪泽湖生态农业生物技术重点实验室提供。
2.2 培养基的选择
LB (Luria-Bertani) 培养基 (1 L)：备置该培养基需要胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g这些基本试剂。同时需要补足水至1L，用1 mol/l的NaOH调节pH至7.0-7.2，固体培养基在以上成分基础上加入12g琼脂粉，分装后121°C湿热灭菌20min，备用。本试验所用到的种子培养液即LB培养液。
2.3 主要仪器的来源
表1 实验使用的主要仪器
仪器 | 型号 | 厂家 |
摇床 | DHZ-DA | 太仓市仪器设备厂 |
培养箱 | GXZ | 宁波江南仪器制造厂 |
解剖镜 | SMZ-140 | Motic |
密pH计 | PHS-3C | 上海雷磁仪器厂 |
超净工作台 | SW-CJ-1F | 苏州安泰空气技术有限公司 |
天平 | BS-210S | 北京赛多利斯天平有限公司 |
涡旋振荡器 | XW-80A | 上海沪西分析仪器有限公司 |
自动蒸汽压力灭菌锅 | D-1 | 北京发恩科贸有限公司 |
2.4 试剂类型
各种生理生化试剂均为国产分析纯。
2.5 生防菌的制备
将-70℃冰箱保存的菌株划线在LB（LB配方：氯化钠10 g/l, 胰蛋白胨10 g/l, 酵母浸粉5 g/l，调节pH值为7.2。）固体培养基上，置28℃培养箱培养12h，待长出单菌落接种到LB培养液中，28℃培养、200rpm振荡培养16h，每隔2 h在超净工作台中取样测600nm处的OD值，当OD值为0.8时结束培养作为种子菌液。把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、200rpm培养16、24、32、40、和48h，分别取出不同时间段的菌液，然后4000 rpm离心15min，分开沉淀和上清，取沉淀用同等体积灭菌水重悬浮，将各菌悬液浓度调节成一致，均为1.0×108CFU/ml，制备得到菌悬液。
2.5.1 霜霉病孢子囊悬浮液的制备
傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(采摘前一周没喷施过农药)，用冰盒带回实验室，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于18℃培养箱中黑暗保湿培养，24 h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊，双层纱布过滤，12000 rpm离心15min，弃去上清液，用灭菌水稀释至105个孢子囊/ml，在18℃培养箱中黑暗保持2-3 h，待有大量游动孢子囊出现时使用。待培养的孢子囊大量出现时候，用无菌水刷下，保存在90%乙醇中，放置于-20℃冰箱（张艳菊等，2007）[16]。
2.6 致病性测定
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