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摘 要

以生长状况良好的马铃薯品种Desiree无菌苗的茎段为材料，利用根癌农杆菌介导法将植物表达载体pBIN19/glgB-SBD 转化马铃薯，并对影响农杆菌转化马铃薯的条件(菌液浓度、侵染时间、预培养及共培养时间)进行了研究。结果表明：通过比较不同的转化条件，初步建立了适合马铃薯品种Desiree 的简单高效的转化体系，并获得了马铃薯转基因植株。茎段预培养2天，以OD₆₀₀ = 0.8的农杆菌菌液侵染10min，共培养2天，能够获得较高的抗性愈伤组织频率和较低的茎外植体污染率。上述条件的优化大大提高了马铃薯遗传转化效率，农杆菌介导的淀粉分支酶基因glgB导入马铃薯品种De的遗传体系初步建立并获得了转化植株。

关键词：马铃薯，农杆菌，遗传转化

Abstract: The aim of this study was to optimize the transformation system for potato variety ‘Desiree’ and to obtain transgenic potato. The glgB-SBD gene was transformed into potato by Agrobacterium tumefaciens and the effects of different transformation conditions (the concentration of Agrobacterium tumefaciens, duration of infection, time of pre-culture and co-culture) were studied. The results showed that the highest resistant calli and lowest pollution frequency were obtained when stem segments were pre-cultivated for 2 days, EHA105 concentration OD₆₀₀ 0.8 and infected in 10 min, co-cultivated for 2 days. Optimization of these conditions has greatly enhanced the efficiency of potato genetic transformation. Transformation system for potato cultivars “Desiree” was preliminarily set up and the transgenic plants were obtained.

Key words: potato, Agrobacterium tumefaciens, genetic transformation

目录

1 前言 4

2 材料和方法 4

2.1 植物材料和试剂 4

2.2 菌株与质粒 5

2.3 主要仪器 5

2.4 培养基 5

2.5 农杆菌工程菌菌液的制备 5

2.6 根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化 5

2.7　转基因植株的PCR检测 6

3 结果与分析 7

3.1 马铃薯茎段Kan抗性的确定 7

3.2 马铃薯遗传转化体系的优化 7

3. 3 转基因植株的PCR检测 10

结论 11

参 考 文 献 12

致 谢 13

1 前言

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是一种分布广泛、适应性强、产量高、营养丰富的粮食兼经济作物,其产量仅次于水稻、小麦和玉米,居第四位。马铃薯是世界上重要的粮食和经济作物之一，其淀粉含量特别丰富。马铃薯块茎中含16-22%的淀粉^[1]。马铃薯属于同源四倍体无性繁殖作物，由于其高度杂合性，常导致自交不亲和及雄性不育，从而降低了用常规育种方法进行马铃薯改良的效率。由于使用常规育种方法进行马铃薯育种需要的时间长、困难大，因此利用基因工程技术提高马铃薯产量和品质是一种行之有效的方法。

农杆菌介导的遗传转化方法因具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化体的特点而成为马铃薯常用的外源基因转移方法。自1983年第一例农杆菌介导的转基因马铃薯问世以来^[2]，马铃薯遗传转化系统日趋成熟，但仍存在基因型依赖性问题^[3]、转化率较低、重复性不强等问题。为了获得高效的转化效率，必须在前人研究的基础上继续研究影响马铃薯遗传转化效率的因素，并尽可能根据实际情况优化遗传转化体系。目前关于马铃薯Desiree品种的遗传转化已有报道^[4]，为进一步提高转化效率，对一些影响转化效率的因素进行探讨。

2 材料和方法

2.1 植物材料与试剂

本实验以马铃薯栽培品种Desiree的无菌苗为植物材料，取苗龄3周的生长状态良好的无菌苗茎段为转化的受体材料。

实验所用卡那霉素(Kanamycine,Kan)购于荷兰Sigma公司,头孢霉素(Cefotaxime ,Cefo)购于Amresco公司,乙酰丁香酮(Acetosyringone ,AS)购于BBI公司,所用玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基嘌呤(6-BA)为中国医药集团上海化学试剂有限公司产品。其他试剂均为分析纯。

2.2 菌株与质粒

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，含植物表达载体pBIN19/glgB-SBD重组质粒(由本实验室构建)。pBIN19/glgB-SBD质粒上主要携带大肠杆菌淀粉分支酶基因（glgB-SBD）和选择标记基因卡那霉素（Kan）抗性基因nptⅡ。

2.3 主要仪器

低速离心机，水浴锅，剪刀，PCR仪，移液枪，干燥箱，电泳仪，凝胶成像系统等。

2.4 培养基

农杆菌菌液培养选用LB培养基，马铃薯遗传转化涉及的培养基如表1。

表1.相关培养基配方

培养基编号	培养基类型	组成*
M1	预培养培养基	MS 0.1mg/L 2,4-D 1mg/L 6-BA
M2	共培养培养基	M1 100μmol/L AS
M3	诱导愈伤培养基	M1 250mg/L cefo
M4	芽分化培养基	MS 1mg/L GA3 1mg/L ZT 250mg/L cefo 50mg/L Kan
M5	生根培养基	MS 250mg/L cefo 50ma/L Kan

*以上培养基中,均添加蔗糖30g/L和琼脂8g/L, pH为5.8。

2.5 农杆菌工程菌菌液的制备

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种于含有50 mg/L卡那霉素（Kan）和100 mg/L利福平(Rif) LB液体培养基中，于28 ℃，200 rpm条件下，避光振荡培养过夜。取200 μL菌液接种于50 mL新鲜的上述液体培养基中，于摇床上继续振荡培养至对数生长期。4000 rpm离心10 min收集菌体, 并用MS液体培养基稀释至所需工作浓度,供侵染用。

2.6 根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化

取苗龄约为3周的无菌苗,剪取长度为0.5～1 cm不带腋芽的马铃薯茎段置于预预培养基上，接种时茎段平放于培养基上，在25±1 ℃、光照强度2,000 Lx条件下进行预培养。预培养后在农杆菌菌液中侵染，其间轻轻摇动菌液使茎段与农杆菌充分接触。侵染后用无菌滤纸吸去茎段表面多余的菌液，置于共培养基上,28 ℃，黑暗培养。将外植体转移到愈伤诱导培养基上，在23 ℃，16 h光照的条件下培养3-4周，每隔10 d换1次新鲜培养基。约2周后有大量愈伤组织形成。当抗性愈伤组织长出后，统计抗性愈伤组织诱导率(称为转化率,即形成抗性愈伤组织的外植体数/侵染的外植体总数×100%)，然后将抗性愈伤组织转移到分化培养基上诱导分化，约4周后有大量的丛生芽产生，当抗性芽长出后，统计抗性芽诱导率(即产生不定芽的愈伤组织块数/接种的抗性愈伤组织块数×100%)。当抗性芽长至2-3 cm时，将其剪下转入生根培养基上，23 ℃,16 h光照,进行生根培养,以获得完整抗性植株。以抗性愈伤的得率作为转化效率的比较指标，研究了不同条件对转化的影响。

2.6. 1 预培养时间对转化效率的影响

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