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摘 要

关键词：细胞色素酶P450启动子；GUS报告基因；转基因烟草

Abstract: In present study, a cytochrome P450 gene promoter from Arabidopsis thaliana. Was cloned onto the upstream of GUS reporter gene in binary vector PBI121, in order to construct a binary expression vector PBI121 P450 GUS. The vector was then transformed into tobacco by Agro bacterium tumefactions-mediated method. It was shown that T0 and T1 plants started to express the foreign GUS gene. The results indicated a potential of CYP450 promoter from Arabidopsis thaliana to control the expression of tobacco target gene.

Keywords: Cytochrome P450 promoter; Gus reporter gene; Transgenic tobacco

目录

1 前言 4

2.材料与方法 5

2.1材料 5

2.2 细胞色素酶启动子的克隆 5

2.3 植物表达载体的构建 6

3 结果与分析 8

3.1细胞色素酶基因启动子的克隆 8

3.2 植物表达载体的构建 9

3.3 转基因植株分子鉴定 9

3.4 花瓣特异启动子在烟草中表达特异性分析 10

结 论 12

参 考 文 献 13

致 谢 14

1 前言

细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)是一类具有混合功能的血红素氧化酶系，它广泛存在于动植物及微生物体内，该酶系具有还原性，能以还原态与CO结合并在波长450nm处有最大吸收值，可以和含血红素的单链蛋白质结合^[1]。细胞色素酶系具有催化生物体内多种内源性物质的生物合成功能，该酶系还参与难降解的外源性有机物的生物降解和氧化等，被认为可能是自然界中最具催化作用的生物催化剂之一^[2]。另外，细胞色素酶系在农业、环保、医药、生物等方面也具有重要的研究价值，改酶系近年来已成为许多科学家的研究焦点。

细胞色素酶P450是一类结构类似的、分子量为40-60KD之间的蛋白质。一般情况下，该酶系以膜结合和可溶性两种形态存在于生物体内^[3] 。目前对该酶系的研究多集中在功能研究方面，主要用于临床研究，如该酶系与各种药物以及激素之间的关系，细胞色素酶的氧化性较强，反应极为活跃，在生物反应过程中会同时产生有毒性的活性代谢物^[4]。另外，可溶性细胞色素P450比较容易分离纯化，早在1985年就获得了第一个细胞色素酶P450晶体。该技术为揭示细胞色素P450结构与功能的关系及细胞色素P450的作用机制奠定了基础^[5,6]。

启动子是位于基因转录起始位点上游的一段 DNA 序列，该序列能直接或间接辨认、结合启动子的蛋白质，使后续的转录正常进行，该序列在基因的转录过程中发挥着非常重要的作用，也是目前的研究热点。但是，目前为止，关于细胞色素酶P450作为启动子在植株中的应用研究较少，基因芯片数据（图1）显示该酶系在花瓣中表达的较高，而在植物的其他器官表达量较少，有的器官甚至不表达，本实验根据基因芯片数据，从拟南芥中克隆细胞色素酶基因P450的上游启动子序列，将其克隆并转化到烟草中。通过对转基因烟草的各器官GUS染色分析，根据染色结果，检测该酶系在烟草中的表达位置。

图1 细胞色素酶P450基因芯片数据

Fig.1 The data of gene chip for cytochrome p450

2.材料与方法

2.1材料

用于克隆该酶系的母本为拟南芥基因组DNA，拟南芥种子有本实验室保存。遗传转化的受体植物本生烟（Nicotiana benthamiana）种子由中国农业科学院油料作物研究所提供，用于克隆以及载体构建的各材料均由本实验室购买和保存。

2.2 细胞色素酶启动子的克隆

2.2.1 拟南芥总DNA的提取

以野生型拟南芥幼叶为材料，采用CTAB法提取基因组总DNA^[7]。

2.2.2 引物设计

根据细胞色素酶P450基因（Genbank accession number: At1g01600）序列，设计并合成PCR扩增引物：

P1: 5’CGTTATGAGGCTTGCAGCACCGTGA3’

P2: 5’CTACGATCGGTAGCTCATAATTGTAACCCAGAGA3’

为了便于PCR产物后期的酶切连接，在引物P1/P2序列中分别加入了不同的酶切位点。

2.2.3 PCR扩增目标片段

在50 μL反应体系中分别加入1 μL拟南芥基因组DNA（50 ng）、5 μL dNTP(2mM)、2 μL MgSO₄(25 mM)、1 μL引物（25 μM）和1 μL的KOD Plus高保真DNA聚合酶（1 U）。经94℃变性2min后，94℃30s，64-60℃（每个循环降0.5℃）30s，72℃ 2min15s 8个循环；94℃ 30s，60℃ 30s, 72℃ 2min15s, 25个循环；72℃延伸2min。1％琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物和目的片断大小一致。

2.2.4 PCR产物纯化

在进行基因片段的酶切和连接之前，首先对PCR产物进行分离纯化，该过程使用PCR纯化试剂盒。纯化结束后，将其克隆到中间载体pZero Amp上，然后转化到感受态大肠杆菌内进行扩繁。

2.2.5 阳性克隆筛选

将转化后的大肠杆菌阳性克隆进行PCR筛选，筛选体系（25µl体系）如下：

10×Taq酶Buffer（含(NH₄)₂SO₄） 2.5µl

MgCl₂ 2 mM

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