摘 要

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种由赖氨酸单体通过聚赖氨酸合成酶（Pls）组装而成的物质，基本上都是是由25-35个L-赖氨酸单体进行脱水缩合形成，分子量一般可达到3200-4500 Da,而且ε-PL在多个领域有广泛的作用，例如防腐剂和食品增稠剂等等。在代谢途径中，ε-PL的直接前体L-赖氨酸经过天冬氨酸代谢途径生成，而天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)正是此步骤的限速酶。我们做的实验是以白色链霉菌S.albulus PD-1为研究对象，构建天冬氨酸激酶基因（ask）过表达菌株PD-1-ask。然后进行发酵实验，摇瓶产量为1.632g/L，比原始菌株提高了48.36%。5L发酵罐产量为31.14g/L，相比增长了44.43%。结果表明，过表达ask促进了前体L-赖氨酸的生成，从而使得ε-PL的产量进一步提高，为ε-PL的代谢调控奠定了基础。

关键词：ε-聚赖氨酸 天冬氨酸激酶 白色链霉菌 赖氨酸 过表达

Overexpression of Aspartic Acid Kinase Enhances Streptomyces albicans Poly - Lysine Synthesis

Summary

Ε-polylysine (ε-PL) is a substance obtained by assembling lysine monomer through polylysine synthase (Pls), essentially consisting of 25-35 L-lysine Acid monomer is dehydrated and condensed to form a molecular weight of generally 3200-4500 Da, and ε-PL has a wide range of functions in various fields, such as preservatives and food thickeners. In the metabolic pathway, the direct precursor of ε-PL, L-lysine, is produced by the aspartic acid metabolic pathway, and the aspartokinase (AK) is the rate-limiting enzyme of this step. In this study, the aspartate kinase gene (ask) overexpressing strain PD-1-ask was constructed by S. albulus PD-1. And the fermentation experiment was carried out. The yield of shake flask was 1.632g / L, which was 48.36% higher than that of the original strain. 5L fermentor production was 31.14g / L, an increase of 44.43%. The results showed that overexpression had promoted the production of precursor L-lysine, which further improved the yield of ε-PL and laid a foundation for the regulation of ε-PL metabolism。

Key words: ε-polylysine aspartate kinase, Streptomyces lobase, overexpression

目 录

摘 要 2

Summary 2

第一章 文献综述 4

1.1 前言 4

1.2 ε-聚赖氨酸的研究进展 5

1.2.1 ε-聚赖氨酸的理化性质 5

1.2.2 ε-聚赖氨酸的应用 5

1.2.3 ε-聚赖氨酸的发酵和生产 7

1.2.4 ε-PL的生物合成及降解 8

1.3 天冬氨酸激酶的简介 9

1.3.1 天冬氨酸激酶的来源 9

1.3.2 天冬氨酸激酶的研究概况 10

1.3.3 天冬氨酸激酶在聚赖氨酸代谢途径中的作用 11

第二章 实验材料与方法 12

2.1 实验仪器及试剂 12

2.2 菌株与质粒 13

2.3 培养基 13

2.4 ask的引物设计与合成 14

2.5 ask的克隆 14

2.5.1 基因组DNA的提取 14

2.5.2 常规PCR反应体系及反应条件 14

2.6 ask的过表达 15

2.6.1 ask过表达载体的构建 15

2.6.2 ask的过表达 15

2.7 培养条件 15

2.7.1 斜面培养 15

2.7.2 种子培养 15

2.7.3 摇瓶培养 15

2.7.4 5L发酵补料分批发酵 16

2.8 分析方法 16

2.8.1 ε-PL的检测方法 16

2.8.2 残糖的检测方法 16

2.8.3 菌体干重的检测方法 16

第三章 结果与讨论 17

3.1 ask的过表达 17

3.1.1 S. albulus PD-1中ask序列的获取 17

3.1.2 pIB139-ask质粒的构建 17

3.2 发酵结果对比 18

3.2.1摇瓶发酵对比 18

3.2.2 5L发酵罐发酵对比 18

3.3 总结 19

第四章 展望 20

参考文献 20

致谢 22

1. 文献综述

1.1 前言

食品的腐败是一种微生物的反应过程，如何解决食品过快腐败一直是一个难题。因为它直接造成了消费者的健康困扰。而且由于食品腐败问题，每年都会有巨大的经济损失。所以如何防止食品的腐败变质成为了食品行业发展的一个刻不容缓的研究问题，有关食品防腐剂的研究如日中天。研究表明，化学防腐剂在剂量范围内使用是不会对人体造成危害的。但是如果超量的话，这种产品也会像一般药物一样对人体产生毒副作用。如果要作为防腐剂加入食品的话，安全性应该作为第一考虑要素。再加上其他考虑因素。恰好，天然防腐剂就有着安全性高、稳定性好，使用范围广泛等优势。因此，随着天然防腐剂不断深入研究，它在食品工业中的地位也日益提高。目前，国外一些发达国家批准使用微生物食品防腐剂有乳酸链球菌素(Nisin)，纳他霉素(Natamycin)和ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-ly-sine)。

我国早已经批准了上述前两种微生物防腐剂关于食品防腐保鲜的应用。ε-聚赖氨酸是一种具有广普抑菌性的新型食品抑菌剂，它具有强烈的抑菌性，尤其是对于一些特殊的芽孢杆菌和真菌。并且由于它的一些优良特性，在食品和医药行业的部分应用也十分成功。目前已知日本是最早实现ε-PL通过微生物发酵进行工业化生产的国家。年产值已经接近千吨，并且关于ε-聚赖氨酸的现代化工业装置已经形成流水生产线。但是令人遗憾的是该技术在国内还处于襁褓阶段，ε-聚赖氨酸生物防腐剂的开发和生产还处于起步阶段，可以断言的是如果国家可以重点投入资金扶持这一技术的研发，它在未来几年里创造的经济效益将不可估量。然而目前来看，天然食品防腐剂价格还是普遍偏高，阻碍了其推广和应用。能否提高天然食品防腐剂的生产效率及能否降低生产成本，已经成为决定其能否大范围推广应用的最主要因素。按照现在的实际情况来看生物发酵法是目前最主要的微生物源防腐剂制作方法，于是我们可以通过运用现代生物技术手段，对天然食品防腐剂的菌种进行筛选并且对发酵工艺进行优化改进，从而可以有效提高生产效率，降低生产成本。