1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

三氯生是一种常用的抗菌剂，广泛用于高效药皂(卫生香皂)、卫生洗液、消毒洗手液、伤口消毒喷雾剂、医疗器械消毒剂、卫生洗面奶(膏)、空气清新剂及冰箱除臭剂等，也用于卫生织物的整理和塑料的防腐处理，更高纯度的三氯生制剂(克力恩)还广泛用于治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡等的疗效牙膏及漱口水中。

近期美国的研究报告称，三氯生与经过氯消毒的水接触后会产生氯仿(三氯甲烷)，如长期使用，可透过皮肤吸入，会导致抑郁、肝病，甚至癌症。三氯生安全问题开始引起人们的关注[2]。本课题拟从生物代谢解毒三氯生的角度出发，选择莱茵衣藻为研究对象，探究莱茵衣藻对三氯生的解毒作用，以期为探索水环境三氯生生物修复方法提供理论依据。

1 三氯生概况

1.1 三氯生简介

三氯生(Triclosan)，结构式见图1，分子量为289.5，熔点为57#177;1℃，沸点为297#177;1℃，是一种不易水解和难挥发的物质，是一种亲脂性化合物。是一种外用高效广谱抗菌消毒剂，又称为二氯苯氧氯酚、三氯新、克力恩、抑菌纯、卫洁纯、洁美新、三氯沙，常态为白色或灰白色晶状粉末，稍有酚臭味。

1.2 三氯生的危害

近期，美国FDA公布了对三氯生抗菌的研究结果，其结果表明添加三氯生的抗菌皂的抑菌能力与普通肥皂并无显著差异，且三氯生通过生活污水能够大量释放到周边环境，对水生生物造成严重影响，并对人体健康构成威胁。并同时宣布在日用品中严格控制三氯生的使用，在牙膏和抗菌皂中严禁使用三氯生。除此之外，由于三氯生大规模使用，在女性脐带血和乳汁中也检测到三氯生残留[1]。

然而，浓度低的三氯生毒性较弱，却没有引起足够的关注。但是在一定条件作用下，三氯生可生成其他有毒中间产物[2]。曾有报道发现水中的三氯生在紫外线照射的条件下，会光解生成毒性较大且有强致癌性的二噁英[3]。另外，三氯生对藻类也生长有抑制作用且浓度越大抑制作用越强。

2 莱茵衣藻概况

2.1 莱茵衣藻结构特点

莱茵衣藻恻属于绿藻门,等鞭毛纲,团藻目,衣藻属,是常见的淡水绿藻币[4]。莱茵衣藻是一种单细胞真核藻,个体呈球形或卵形,前端由两条等长的鞭毛,能游动鞭毛基部有伸缩泡两个细胞近前端,有红色眼点一个原生质体中有个杯装叶绿体,叶绿体基部通常埋有个大的蛋白核。图2为莱茵衣藻电镜结构示意图。

图2莱茵衣藻的结构示意图

2.2莱茵衣藻的生理特点

莱茵衣藻具有生长周期简单、生长快、世代时间短的特点。此外,莱茵衣藻在光照和黑暗条件下均能生长,且能把外界提供的碳源与光合成的碳物质分开,也是目前唯一能特异的对线粒体、叶绿体和核分别建立转化系统的生物[4]。

在外界环境其不适宜生长，如在氮源严重不足的条件下，莱茵衣藻会转为有性生殖，以应对不利环境[5]。因而,莱茵衣藻也作为一种重要的测试生物,而被广泛应用于农药及其他化学品的生物测中。

3 解毒酶

3.1 植物细胞色素p450

植物细胞色素P450是一种结构类似的一类血红素硫铁蛋白，分子量为40-60KD。在植物细胞内主要以可溶性与膜结合的形态存在,可催化多种化学反应,在防御植物免受有害物质侵害方面发挥着重要作用[6]。在细胞中，细胞色素P450主要分布在内质网和线粒体内膜上，作为一种末端加氧酶，参与了生物体内的甾醇类激素合成等过程。

近年来，对细胞色素P450的结构、功能特别是对其在药物代谢中的作用的研究有了较大的进展。最新研究表明植物细胞色素P450酶系(P450s)在植物防御性物质的合成以及对除草剂等外源化学物质的解毒方面有着重要的功能[7]。另外细胞色素P450还是药物代谢过程中的关键酶，而且对细胞因子和体温调节都有重要影响。目前已克隆了 90多个植物细胞色素P450基因[8]。

3.2 谷胱甘肽转移酶

植物谷胱甘肽转移酶(GSTs)是一类广泛存在于植物中的多功能蛋白,具有参与调节植物次生代谢、解毒和防御等作用，同时也是一种可以可催化还原型谷胱甘肽与各种亲电子化合物进行亲核加成反应的一种多功能药物代谢Ⅱ相酶[9]。其拥有众多基因编码、具有多种功能的超家族酶,是多种植物体内的主要解毒系统。研究表明,除草剂及除草剂类似物、机械损伤、氧化胁迫、高温等外界逆境均可以诱导GST的合成。乙烯、生长素、细胞分裂素等植物激素也在不同程度上刺激GST的合成[10]。

4 植物的解毒效应

4.1 藻类对汞的耐受机制

汞是少数具有生物放大能力的金属，很容易通过海底浮游植物富集[11]。在汞胁迫条件下，一般来说植物会启动一些解毒机制来维持生命力和细胞活力，从而保护自身免受伤害。其中一种包括诱导植物启动抗氧化保护系统来产生防御作用。另外汞还可诱导一些特殊的重金属解毒机制。如汞可以诱导植物产生一些抗胁迫相关的蛋白，如几丁质酶、热休克蛋白等相关蛋白等，这些蛋白的产生有助于提高植物耐汞性[12]。

植物体内有一套自身完整的清除ROS(需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇)的系统，将其转化为活性较低的物质，起到保护的作用。在长期进化过程中植物形成了两套清除ROS的系统，一套是由超氧化物歧化醇、过氧化物酶、和过氧化氧酶等抗氧化酶组成的酶系统，另一套是由谷胱甘肽和抗坏血酸等抗氧化剂组成的非酶系统[12]。这两套系统在汞胁迫下都能发挥重要的作用。

4.2 藻类对铜胁迫的响应及调节机制

铜是植物生长必须的微量元素，并且在植物新陈代谢和维持金属动态平衡中起着重要作用。在莱茵衣藻中铜主要以三种酶的形式存在：叶绿体中的细胞色素氧化酶，线粒体中的质体蓝素以及与铁积累相关的多铜氧化酶[13]。但高浓度的铜却会成为细胞的植物毒素，引起植物生长抑制甚至死亡。最近有研究证明，植物细胞内过多的铜将激活分子氧并产生氧自由基。铜诱导细胞产生过氧化氧，羟基自由基及其它活性氧自由基[5-13]，这些自由基与细胞膜脂质核蛋白的损害直接相关。

植物对铜毒的响应机制之一就是产生脯氨酸，脯氨酸与保护植物对抗氧化损害和信号转导都有关联。还有一类就是生物活性气体分子一氧化氮(NO)，最近有研究表明一氧化氮也能参与调节环境胁迫，但重金属诱导的脯氨酸积累与胞内产生一氧化氮之间的关系始终却未得到建立[14]。

4.3 植物对除草剂的解毒机制

如今农业生产中已广泛应用除草剂选择性地控制大田中竞争性杂草的生存。但是某些植物对除草剂天生具有耐性,通过研究现已证明,植物能通过一系列酶促反应代谢和解除除草剂毒害。其中主要途径有以下几种：1.依赖细胞色素P450的单加氧酶氧化除草剂2.糖基转移酶使除草剂糖基化3.谷胱甘肽转移酶(GST)使除草剂与谷胱甘肽结合[15]。

5 课题研究目的与意义

由于三氯生及其衍生物具有亲脂性、生物累积性、持久性和生物毒性等特点，有研究发现它对水生生物、哺乳动物有轻度致畸性和可损伤肌肉功能的危害，并通过食物链威胁人类健康。同时也是评价外源化学物对水体环境影响的重要指标。本课题拟研究莱茵衣藻对杀菌剂三氯生解毒效应，为探索水环境三氯生生物修复方法提供理论依据。

参考文献

[1]郑欣,刘婷婷,王一喆,王晓南,刘征涛,张亚辉,杨霓云,闫振广. 三氯生毒性效应及水质基准研究进展[J]. 生态环境学报,2016,(03):539-546

[2]徐琴. 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CAO基因与CBN1基因功能对比分析的研究[D].新疆大学,2005.

[3]廖伟. 拉米夫定和三氯生的光降解动力学及其水生生物毒性评价 暨南大学 ，2012

[4]王潮岗,王菲,胡章立. 莱茵衣藻在本科实验教学中的应用[J]. 生物学通报,2013,(06):44-47.

[5]成珍珍. CrGNAT调节莱茵衣藻耐铜毒害的初步研究[D].南京农业大学,2014.

[6]刘宛, 李培军, 周启星,等. 植物细胞色素P450酶系的研究进展及其与外来物质的关系[J]. 环境工程学报, 2001, 2(5):1-9.

[7]李明,曾任森,骆世明. 细胞色素P450酶系与植物的化学防御[J]. 中国植保导刊,2006,(11):13-15.

[8]贺丽虹,赵淑娟,胡之璧. 植物细胞色素P450基因与功能研究进展[J]. 药物生物技术,2008,(02):142-147.

[9]张亚真,张芬,王丽鸳,韦康,成浩. 植物谷胱甘肽转移酶在类黄酮累积中的作用[J]. 植物生理学报,2015,(11):1815-1820.

[10]宋长芹,缪海飞,朱斌,佟少明,李泽昀,侯和胜. 植物谷胱甘肽-S-转移酶在植物修复中的作用[J]. 安徽农学通报(上半月刊),2010,(07):56-110

[11]毋赟,王文雄. 汞在海洋浮游植物中的生物累积和毒性效应[J]. 生态毒理学报2014,(05):810-818.

[12]魏渊源. CO/HO1调节莱茵衣藻汞毒害的作用机制[D].南京农业大学,2010.

[13]王松华,杨志敏,徐朗莱. 植物铜素毒害及其抗性机制研究进展[J].生态环境2003，(03):336-341

[14]张丽萍. NO与CO调节莱茵衣藻铜铁胁迫[D].南京农业大学,2011.

[15]孔玄庆,郭军,金晨钟,欧晓明,吴晓峰,彭秧锡,金雯昕. 农药与藻类互作的研究进展[J]. 现代农业科技,2016,(05):224-228.

[16]陈野,吴小松. 藻类对重金属的耐性与解毒机理[J]. 科技风,2013,(03):12.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1、本课题主要研究的问题

（1）、考察不同浓度的三氯生处理下，莱茵衣藻的丙二醛含量，来评价三氯生对莱茵衣藻膜脂过氧化程度的影响；

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(mda)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。mda从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，mda的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。测定丙二醛含量定量分析莱茵衣藻膜脂氧化程度，能得出不同浓度三氯生对莱茵衣藻脂膜氧化程度，从而来反应莱茵衣藻受伤害的程度。