1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1 海藻糖概述

1.1 海藻糖简介

海藻糖（Trehalose）分子是由两个吡喃型葡萄糖分子通过α，α-1，1糖苷键连接，形成的无半缩醛羟基的非还原性二糖，其化学性质非常稳定，学名为D-吡喃葡萄糖-(1-1)-D-吡喃葡萄糖，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁#183;2H₂O。在1832年，由Wiggers首先从黑麦的麦角菌中提取出来^[1]。

海藻糖有α,α-海藻糖、α,β-海藻糖和β,β-海藻糖三种光学异构体构型，其中α,α-海藻糖是自然界中最广泛存在的一种构型（图1-1），广泛存在于真菌、细菌、植物和动物中^{[2, 3]}。

图1-1 海藻糖分子结构式

1.2 海藻糖的一般理化性质

目前在市场上所流通的海藻糖商品一般以两种形式存在，一是含有二分子结晶水的海藻糖晶体，也是目前主流商品；另一种是不含结晶水的无水海藻糖，其一般理化性质如表1-1。

表1-1 海藻糖理化性质^[4]

2 海藻糖的生物学功能及其保护机制

2.1 海藻糖的生物学功能

海藻糖生物学功能已经被广泛的研究，发现在不同物种中其作用也不相同。海藻糖可以作为生物体的碳源被生物转化形成葡萄糖进而被利用，例如在低等生物体的早期孢子萌发过程中海藻糖被认为充当发育过程的能量来源；也可以作为生物体结构组成的一部分，例如在分枝杆菌中，海藻糖归并为糖脂作为生物体的结构组成部分；在一些微生物中，海藻糖的衍生物以代谢中间体或是一些结构分子的形式存在。

海藻糖更加引人注目的一方面是，当一些生物体在遭遇冰冻、干旱和脱水等恶劣环境时，海藻糖的存在可以维持生命过程的稳定。各种研究表明，在不同的逆境胁迫条件下，海藻糖所表现的抗逆保护作用虽不尽相同，但都是通过对生物体和生物大分子而起的非特异性保护功能^[5]。

2.2 生物保护机制

目前对于海藻糖的生物学性质研究发现，其对生物大分子的保护机理主要分为三类，即分别为”水替代”机制、”玻璃转换”机制和”优先排阻”机制。然而目前这三类机制哪一种在海藻糖生物作用起主导作用还没有具体结论，因为这三类机制并不完全排斥甚至有可能相互间协同作用对生物大分子起保护作用。

3 海藻糖的应用

由于海藻糖其独特的生物学特性使其在食品加工领域和医药领域都有着广泛的应用。并且随着研究的不断深入，海藻糖的应用领域正在不断拓展^[6]。

3.1 在食品加工领域的应用

海藻糖不但甜味清爽、适口，还具有吸湿性、保水性、耐热性和耐酸性；同时还能防止蛋白质变性、淀粉老化、防龋齿性、防止褐变；也可抑制脂类物质氧化变质，保持蔬菜肉类组织结构的稳定性。因此在食品领域可作为理想的甜味剂、食品保鲜剂、品质改良剂、脱水剂等。例如，作为食品保鲜剂可以添加到蔬菜、新鲜水果、肉类中，可以解决常规保藏所致的色泽消失、味道改变、维生素被破坏、以及脂肪酸化等问题。作为品质改良剂应用于调味料、冰淇淋和咖啡用糖等食品中，不仅可以改善口感，同时可以降低食品本身的涩味、苦味及臭味等异味^[7]。

3.2 在医疗领域的应用

海藻糖对生物大分子具有非特异性优良的保护作用，被广泛的应用到血液制品、细胞膜细胞器、细胞组织、疫苗、工具酶、微生态制剂等等的生物活性保护剂中^[8]；近年来的研究还发现，海藻糖对亨廷顿舞蹈症、骨质疏松症、干眼病等都具有非常好的治疗效果，同时还具有抗肿瘤的特效，还是药物传递系统中的良好辅料，这些都扩展了海藻糖在医疗领域的应用。

4 海藻糖制备的研究进展

目前已开发的海藻糖制备方法主要有微生物抽提法、发酵法、酶转化法。从微生物中提取海藻糖，操作成本较高，并且提取源受到限制，因此在很大程度上制约着海藻糖大规模工业化生产；发酵法中物料转化效率低，并且发酵液成分复杂，给海藻糖的提取、精制带来很大的困难，对降低生产成本、促进推广应用等方面很不利^[9]。

4.1 以麦芽糖精为底物的酶转化法（TreY-TreZ途径）

TreY-TreZ途径中，基因TreY和TreZ分别编码麦芽寡糖基海藻糖合酶（Maltooligosyl trehalose synthase，简称MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyl trehalose trehalohyrolase，简称MTHase）。催化过程分为两步：先由MTSase催化底物麦芽糊精，末端的葡萄糖残基发生转糖基作用，生成麦芽寡糖基海藻糖，然后经过MTHase催化水解α-1,4糖苷键生成海藻糖。

麦芽糊精 MTSase 麦芽寡糖基海藻糖 MTHase 海藻糖

目前已证实该途径存在于细菌和古生物中，如根瘤菌（Rhizobium sp.）、耐辐射奇异球菌（Deinococcus radiodurans）、水生黄杆菌（Flavobacterium aquatile）、节杆菌（Arthrobacter sp.）、微黄短杆菌（Brevibacterium aquahelvoum）以及结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）等^[10]。

4.2 以麦芽糖为底物的分子内转糖基途径（TreS途径）

TreS途径，海藻糖合酶（Trehalose synthase，简称TreS）通过分子内转糖基作用，把α,α-1,4糖苷键转化为α,α-1,1糖苷键，将底物麦芽糖直接转化为海藻糖。

麦芽糖 ^TreS 海藻糖

1995年，日本林原生化^[11]从脂肪杆菌(Pimelobacter sp. R48)中提取得到海藻糖合酶，随后在水生栖热菌(Thermus quatieas)，恶臭假单抱菌(Pseudomonas putida)等中都提取到该酶。该酶蛋白可以直接作用于麦芽糖底物，将麦芽糖分子的α,α-1,4糖苷键通过分子内转糖苷一步转化为α,α-1,1糖苷键的海藻糖。

5 全细胞催化技术

全细胞催化指的是利用完整的生物有机体（即全细胞、组织甚至是个体）作为催化剂进行生物催化，但其本质还是利用生物有机体自身内的蛋白酶进行催化反应^[12]。相比于发酵法技术，全细胞催化技术克服了发酵法本身的限制因素，如发酵法生产周期一般都较长、代谢产物比较复杂、底物转化率较低、产物提取分离较为困难以及能耗较高，等诸多限制因素。而相对于酶分离提取后的催化反应，全细胞催化的优势在于全细胞中各酶系保持原有所处的环境和区域，可以提高酶的稳定性，延长酶的半衰期等，而且酶催化反应同时具有能量和辅酶等物质的原位再生能力；胞内的完整的多酶体系同时还可以实现酶的级联反应，弥补了多酶催化体系中级联反应不易实现的缺点，提高了酶的催化效率。全细胞催化体系还可重复批次进行底物催化反应，大大提高了酶的使用效率，同时还省去了酶分离纯化过程中的繁琐程序，使得生产成本大大降低。

5.1 全细胞催化技术在工业生产中的应用

2001年，Ban等^[13]人首次将米根霉全细胞固定在生物基颗粒（biomass support particles,BAP）上，从而创建了全细胞生物催化技术，并成功的应用到了生物柴油的的生物转化的研究当中。随后，又有很多研究人员将米根霉全细胞固定在BSP上应用于利用植物油转化成生物柴油，对原料、培养基、有机溶剂以及含水量等都进行了详细的研究，获得了很多重要进展^[13-16]。目前，许多产品已成功运用了全细胞催化技术生产。

5.2 透性化方法

根据目前的研究方向来分类，细胞透性化方法主要可分为化学法、物理法和生物法这三种方法。

（1）化学法

化学法是目前研究最多也是最常用的一种细胞透性化处理技术。该方法优势在于较容易得到放大和应用于工业化生产，但其缺点也比较明显，造成分离困难以及环境污染。其主要机理是透性化试剂先穿过细胞细胞壁，然后与细胞膜上的脂质物质发生反应，进一步破坏磷脂双分子层的结构和流动性，从而增加了细胞膜的通透性。

（2）物理法

物理法的原理是通过利用物理手段对细胞的细胞膜和细胞壁的形成结构性损伤，从而来提高细胞的通透性。物理法具有效率高、参数易控制、无毒性等优点，但其缺点是难以完成工业化放大。物理法包含渗透压休克法、温度冲击法、超声法等几种方法。

（3）生物法

生物法是指利用一些可生物降解的生物分子（例如：抗生素、酶、多糖等）对全细胞进行透性化处理的方法。目前生物法的主要研究方向是研究上述分子抗菌能力的作用机制和特点等。

5.3 全细胞催化技术在海藻糖制备上的研究进展

海藻糖合酶归属于胞内酶，传统提取工艺通常先将细胞破碎后，再经过分离纯化后才可使用，酶活损失较大，且操作复杂，设备投资大，制约了其在工业生产中的应用^[17]。而采用通透性处理细胞技术，在不破坏细胞整体内部有机结构的前提下改变细胞壁和细胞膜的通透性， 使得小分子底物能够自由进出细胞膜的技术，即利用全细胞催化技术则有望克服上述缺点^[18]。

6 本论文研究目的和主要内容

海藻糖化学性质稳定，在食品、医药、生物领域都有着广泛的应用。目前海藻糖生产的方法主要为双酶法和单酶法催化相应底物，其中由海藻糖合酶一步催化麦芽糖生产海藻糖的方法具有工艺简单，原料成本低，酶源丰富等优点，具有广阔的应用前景。但是目前现有的海藻糖生产工艺路线存在以下缺点：一、细胞破碎方法多采用物理破碎，大规模使用使酶失活，使得酶使用效率普遍不高；二、细胞破碎后会引入胞内复杂成分，增加分离纯化压力，加大了分离的工业成本；三、价格高昂的原料，增加了生产成本，降低了企业效益。

本论文即在此基础上，利用全细胞催化技术，更加高效地利用海藻糖合酶，旨在开发出一条适合大规模工业化生产海藻糖的工艺路线。针对以上问题，本研究主要内容包括两个个方面：

一是以本实验室构建的基因工程菌出发，通过发酵后离心分离得重组大肠杆菌菌体，利用脂肽类生物表面活性剂处理大肠杆菌形成透性化细胞，并确定最适条件，利用全细胞催化麦芽糖底物合成海藻糖，重复批次催化，进一步提高海藻糖合酶的利用效率。

二是考察了利用全细胞催化麦芽糖合成海藻糖的工艺，探究了其全细胞催化的重点影响因素。最终使得细胞无需外源处理，即可利用全细胞催化麦芽糖底物生成海藻糖，重复批次利用，提高了酶的使用效率，进而降低了工业生产成本。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题研究的内容：

（1）是以本实验室构建的基因工程菌出发，通过发酵后离心分离得重组大肠杆菌菌体，利用脂肽类生物表面活性剂处理大肠杆菌形成透性化细胞，并确定最适条件，利用全细胞催化麦芽糖底物合成海藻糖，重复批次催化，进一步提高海藻糖合酶的利用效率。

（2）是考察了利用全细胞催化麦芽糖合成海藻糖的工艺，探究了其全细胞催化的重点影响因素。最终使得细胞无需外源处理，即可利用全细胞催化麦芽糖底物生成海藻糖，重复批次利用，提高了酶的使用效率，进而降低了工业生产成本。