摘 要

目的：本文以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cytochrome C Oxidase Subunit I ,COI ）基因为目的基因，运用DNA条形码技术鉴定南京市场上采集的42份新鲜和冷冻水产品的物种来源，并判定样品标注的物种名的真实性。结果：29份样品成功扩增出约650bp的COI 基因片段，剩余13份样品则无法扩增成功。而成功扩增的29份样品测序获得的序列经BOLD数据库对比，其中22份样品能鉴定到物种水平（最大相似度≥98%），剩余7份样品则无法在物种水平完成鉴定。6份样品都只标注代表一大类鱼的总称或俗称，无法判定是否存在错标，只有4份样品同时标注了拉丁学名，且其中3份样品与鉴定结果不一致，1份则无法鉴定到物种水平。结论：DNA条形码技术可以对各种鲜、冻水产品样品进行较为快速、有效、精准的鉴定。同时，我国水产品物种标示管理混乱，概念模糊，急需建立规范化的物种标示规则。

关键词：DNA条形码；鲜冻水产；COI基因；物种鉴定

Application of DNA Barcoding to Identify the Species Composition of Common Aquatic Products on Nanjing Market

Abstract

Objective: To study the Cytochrome C Oxidase Subunit I (COI) gene as the target gene, and to identify 53 species of fresh and chilled aquatic product collected in Nanjing market by DNA barcode technique. And determine the authenticity of the sample labelsl. Results: 42 samples successfully amplified about 705bp of COI gene barcode fragments, and the remaining 11 samples could not be amplified successfully. While 42 samples sequenced successfully amplified sequences obtained by BLAST and BOLD database comparison, of which 30 samples were identified to species level (maximum similarity is greater than or equal to 98%), the remaining 12 samples cannot be identified at the species level (maximum similarity lt; 98%). The 47 samples were only labeled as a generic or common name of a large class of fish. It was not possible to determine whether there were any errors. Only 6 samples were labeled with Latin names, and 2 of them were inconsistent with the results of the identification. Conclusion: DNA barcoding is a rapid and effective molecular technique that can be used for identification of species sources in frozen and fresh aquatic products. At the same time, the management of aquatic product labeling in China is confusing and the concept is vague, so it is urgent to establish standardized species labeling rules.

Key Words: Fresh and frozen aquatic products; DNA barcode; species identification; COI gene

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 我国鲜、冻水产品市场现状 1

1.1.1 我国水产品的消费现状 1

1.1.2 我国水产品市场存在的问题 1

1.1.2.1 微生物污染 1

1.1.2.2 兽药残留 1

1.1.2.3 水产品品种掺假 2

1.2 水产品品种鉴定技术 2

1.2.1 基于蛋白质的品种鉴别技术 2

1.2.1.1 酶联免疫吸附 2

1.2.2 基于DNA的品种鉴别技术 3

1.2.2.1 RFLP 3

1.2.2.2 实时PCR 3

1.2.2.3 DNA条形码 4

1.3 本项目的目的和意义 4

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1 材料与试剂 5

2.1.2 仪器与设备 5

2.2 实验方法 5

2.2.1 DNA提取 5

2.2.2 PCR扩增及产物测序 6

2.2.3 PCR产物序列对比及分析 6

第三章 结果与分析 10

3.1 DNA提取 10

3.2 PCR扩增及产物测序 12

3.3 BOLD比对结果 14

3.3.1 COI基因对比结果 14

3.3.2 样品标签的真实性分析 14

第四章 讨论与展望 17

4.1 市场错贴标签的种类 17

4.2 DNA条形码技术的优势 17

4.3 展望 17

参考文献 19

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 我国鲜、冻水产品市场现状

1.1.1 我国水产品的消费现状

我国是水产品消费大国。2015年，我国城镇、农村居民人均水产品消费量分别为19.34kg和7.61kg，比1995年分别增长了52.4%和59.8%^[1]。由此可见，城乡居民对水产品的消费需求量不断提高。

同时，随着生活水平的提高，人们的消费需求也不断改变，消费者对水产品消费品种的要求越来越高，从以往的就吃四大家鱼青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼到对海水鱼、进口鳕鱼、三文鱼、贝类、虾类等的转变，因此，水产品的消费量不断增加，特别是鱼类产品的消费情况，占我国水产品消费总量的50%以上。因此，为了满足我国人民的消费需求，我国每年从俄 罗斯、日本、美国等地进口各种鱼类等鲜活冷冻水产品约100万吨^[2-3]。就这样，也只是基本满足我国人民的消费。

1.1.2 我国水产品市场存在的问题

1.1.2.1 微生物污染

我国的水产品微生物污染问题越来越严重，引起微生物污染的病原微生物主要包含沙门菌、副溶血性弧菌等细菌。各地时有报道的食物中毒甚至食物致死事件不断刺激着人们对产品微生物污染问题的重视。2016年3月，国家食品药品监督管理总局公示了新一期食品的抽查名单，其中江苏省东昌 钰海苔有限公司因为生产的海苔银中的大肠 菌群超标152倍而被通报；浙江省瑞安市华盛水产有限公司因为生产的熟虾皮被检测到菌落总数超标21倍而被通报^[4]。由此可见，水产品微生物超标、污染问题是分严重，对水产品的微生物进行有效控制就是十分必要的了。控制放方法：1、对水产品生产环境卫生进行严格控制；2、对水产品生产过程中容易滋生的微生物严格检查；3、对水产品的运输过程严格控制。

1.1.2.2 兽药残留

在进行水产养殖的同时，商家为了成本的降低，不断提高饲养密度，随之而来的一个问题就是高发生率的水产病害，致使水产品农药残留问题十分严重，对我国养殖水产品的健康发展、广大消费者的食品安全以及出口能力产生了很大影响。