摘 要

本文对一株生防菌的筛选方法以及菌株的鉴定方法进行了探究。通过选择培养基的选择达到分离纯化菌株的目的，并通过培养过程中的形态学变化以及ITS 序列产物测序对比的方法鉴定菌株，为生防领域淡紫拟青霉的筛选鉴定提供了依据，具有十分重要的研究应用价值。研究结果显示：（1）通过配方为1000 mL 固体 PDA 培养基，10 g 氯化钠，50 mg 75%的五氯硝基苯，0.5 mg 50%的多菌灵(苯来特)，2.5 mL 硫酸庆大霉素( 80万单位)，50 mg 氯霉素的淡紫拟青霉选择性培养基，可以很好的将淡紫拟青霉从取样土壤中筛选出来。（2）培养过程中，形态学的变化符合淡紫拟青霉培养过程中形态学的变化，且通过PCR扩增得到的ITS 序列产物进行电泳检测以及生工测序，在网站上测序对比得到与淡紫拟青霉序列的同源性最高。最终结论得到，所初步筛选的菌株初步鉴定为淡紫拟青霉。

关键词：淡紫拟青霉，生防菌，筛选，鉴定

Screening and Identification of a Biocontrol Bacteria

--Paecilomyces lilacinus

Abstract

This article explored a screening method for biocontrol bacteria and identification methods of strains. The purpose of isolation and purification of the strains was achieved by selection of the selection medium, and the strains were identified through morphological changes in the culture process and sequencing of the ITS sequence products to provide a basis for screening and identification of P. lilacinus in the field of biotechnology. Very important research application value. The results of the study showed that: (1) It was formulated with 1000 mL solid PDA medium, 10 g sodium chloride, 50 mg 75% pentachloronitrobenzene, 0.5 mg 50% carbendazim (benzide), 2.5 mL Gentamicin sulphate (800,000 units), 50 mg chloramphenicol-selective medium of P. lilacinus can be used to screen Paecilomyces lilacinus well from the sampled soil. (2) In the course of culture, the morphological changes were consistent with the morphological changes during the culture of Paecilomyces lilacinus, and the ITS sequence products obtained by PCR amplification were subjected to electrophoresis detection and biosequencing. The results were compared on the website. The sequence of Paecilomyces lilacinus has the highest homology. The final conclusion was that the strain initially selected was identified as Paecilomyces lilacinus.

Keywords: Paecilomyces lilacinus；biocontrol bacteria；screening；identification

目 录

摘要 I

Abstract Ⅱ

第一章 绪论 1

1.1选题背景 1

1.1.1淡紫拟青霉在植物病害中的应用 1

1.1.2淡紫拟青霉的研究现状 2

1.1.3淡紫拟青霉的生防机理及研究意义 3

第二章 材料与方法 4

2.1实验试剂与仪器 4

2.1.1实验试剂 4

2.1.2实验仪器 5

2.2目的菌株的筛选与鉴定 5

2.1.1样本采集与处理 5

2.1.2菌株的筛选 6

2.1.3菌株的形态学鉴定 7

2.1.4菌株的基因组DNA的提取 7

2.1.5 PCR扩增ITS区序列 8

2.1.6琼脂糖凝胶电泳检测 8

2.1.7序列库NCBI检索鉴定菌株 10

第三章 结果与讨论 11

3.1生防菌的初步筛选与初步鉴定分析结果 11

3.1.1实验菌株的筛选结果 11

3.1.2实验菌株的形态学分析 12

3.1.3实验菌株的序列测定与分析 13

3.2讨论 14

第四章 前景与展望 16

参考文献 17

致 谢 19

第一章 绪论

1.1选题背景

1.1.1淡紫拟青霉在植物病害中的应用

现代农业发展迅速，生产水平也是随着技术的发展迅速的提高，但是虫害也一直伴随着我们的生产生活，一直对作物的生长产生着各式各样的危害，而其中，植物线虫的危害是最广泛以及巨大的。植物寄生线虫是一种专性的寄生物，既伤害着根部的组织功能，又能寄生汲取组织营养，还分泌相关的酶或者毒性物质，致使其发生病变，寄主的植物组织完整性在植物线虫的干扰和蚕食中还会受到不同程度的外部损伤，与植物生长相关的代谢活动等都会受其影响，伤口形成了侵入的通道，病原微生物的进入变得更加简单，在植物的生产中，线虫是一类重要的且危害很大的生物^[1]。很多经济作物深受植物寄生线虫的干扰，从而导致经济作物不同程度的减产。在农业上，生物防治已成为杀灭植物寄生线虫的重要手段。

淡紫拟青霉属于内寄生性真菌，作为土壤和许多植物根系的习居菌，是植物寄生线虫的生物防治手段之一，它对许多植物寄生线虫具有抑制作用，包括对孢囊线虫、根结线虫、穿孔线虫等有害线虫^[2,3]，都有非常广泛的应用。对于植物寄生线虫，最开始是使用化学杀虫试剂，但是传统化学试剂农药的使用，让线虫的抗药性以及耐药性等等都会不同程度的增强，使得人类在线虫防治上不得不配制更多的且更有毒害的化学试剂，由此“量变”成为“质变”，农药残留以及环境污染愈演愈烈，对生态，对人类都造成了极大的且不可弥补的危害。生物防治已经是一种趋势，淡紫拟青霉是一些植物寄生线虫的天敌真菌，具有高功效、寄主广泛、易培养等优点。作为生防菌，其主要特点：第一，对于线虫具有高功效，对线虫整个生命周期都有一定的防治作用；第二，对植物生长起积极作用，达到增产等相关目的；第三，降低农药残留，淡紫拟青霉的使用会促进难溶性的磷酸盐溶解，而且能够促进很多化学聚合物例如农药的分解^[4]。不仅如此，多种植物的致病型真菌会受淡紫拟青霉干扰，同时也包括细菌和病毒。

1.1.2淡紫拟青霉的研究现状

在生物防治线虫领域，淡紫拟青霉的使用已经扩散至全世界。在我国， 1985年，淡紫拟青霉作为菌种材料第一次进行可实验研究，开始被许多学者提起，1989年，中国农业科学院植保所的陈品三先生与彭德良先生使用Jatala提供的菌种开展了防止根结线虫的应用试验并且进行了相关报道^[5]。随着科技的进步，关于淡紫拟青霉的大量生防研究开始兴起。淡紫拟青霉有良好的寄生性，且土壤中线虫能被有效杀死，其危害被降至低水平，它的代谢产物也是研究一部分，在植物成长中具有促进生长的活性。谢钦铭^[6]等人在用淡紫拟青霉菌对荔枝蝽象成虫的田间防治实验中，发现淡紫拟青霉对荔枝蝽象具有很强的致病性，可以利用其来有效地控制果园内荔枝蝽成虫的种群数量，大大减少了越冬成虫的基数。许天委^[7]等人在关于海南白木香根结线虫受淡紫拟青霉的影响的研究中，发现这种白木香根结线虫会受到淡紫拟青霉固体菌制剂的控制，且促进作用于其中体现较明显，相比空白组，植物高度对比增加，地上新鲜部分重量也增加。赖宝春^[8]等人使用淡紫拟青霉对灯盏花根结线虫的防效测定中，结果显示经过防治的实验组灯盏花的根部组织发育较好，而未防治的空白组灯盏花的根部组织脆弱，且发育不茂密，会有小部分成团结块，且分布较广，而防治的实验组灯盏花只有少量的结块生长，分布在生长时间较长的根部和靠上的根部，相比未防治的空白对照组，病害情况减轻。

但是，由于露天田间的生态环境复杂且多变，近年来气候条件也在不断变化，致使淡紫拟青霉经常出现防效不稳定且见效较为缓慢的现象^[9,10]。因此，淡紫拟青霉常常和植物组织提取物或者其他生物制剂一起来联合防治，其效果会更加明显。聂海珍^[11]等人利用棉隆对土壤熏蒸，来和淡紫拟青霉对番茄根结线虫病进行联合作用，发现与对照差异显著，淡紫拟青霉数量高于单一淡紫拟青霉菌剂处理，效果更佳显著。闫芳芳等人使用淡紫拟青霉，并结合猪屎豆，发现两者一起作用比淡紫拟青霉单独作用于烟草根结线虫效果明显。当然，联合防治的最终目的也是为了提高淡紫拟青霉产孢子能力、对线虫的作用活性以及菌株的定殖能力，从而使得效果更加明显，这些研究并没有否定淡紫拟青霉的生防力，而是为了放大其作用效果而进行的手段策略。