摘 要

本次试验运用实时荧光PCR检测技术对核桃、花生、豆类饮品中等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定，以鉴定植物蛋白饮料的真实属性。本次试验共采集29种市售样品，在建立稳定的单重实时荧光PCR检测方法基础上，研究确立多重实时荧光PCR检测方法，实现蛋植物白饮料中中多种目标物种基因的高通量快速筛查检测。最后结果显示，29种样品均检测出相应的植物源性成分。本研究方法灵敏度高、特异性强，在DNA核酸水平灵敏性实验检测中，大豆特异性体系可检测到的大豆DNA最低检测限为10%，花生和核桃特异性体系可检测到的DNA最低检测限均为5%；大豆样品混合测定的检测限最低为0.01%。本研究所建立的方法为植物蛋白饮料制品监管提供可靠有力的技术手段，具有重大的经济效益与社会效益。

关键词：荧光PCR 植物源性成分 产品分析

Identification of Plant-derived Components in Plant Protein Beverages and Analysis of Related Commercial Products
Abstract

This experiment uses real-time fluorescence PCR detection technology to detect and identify walnut-derived, peanut-derived, and soy-derived components in walnuts, peanuts, and legume beverages and medium plant protein beverages to identify the true properties of plant protein drinks. In this study, a total of 29 commercially available samples were collected. Based on the establishment of a stable single-fold real-time fluorescence PCR detection method, multiple real-time fluorescence PCR detection methods were established to achieve high throughput of multiple target species in egg white beverages. Rapid screening tests showed that the 29 samples were all tested for their corresponding plant-derived components. This method has high sensitivity and specificity. In the detection of DNA nucleic acid level sensitivity, the minimum detection limit of soybean DNA detected by the soybean-specific system is 10%. The minimum detectable DNA of peanut and walnut specific system can be detected. The limit is 5%; the detection limit of the soy sample mixing assay is a minimum of 0.01%. The method established by this Institute provides reliable and powerful technical means for the supervision of plant protein beverage products, with significant economic and social benefits.

Keywords: Real-Time PCR; Plant-derived ingredients; product analysis

目 录

摘 要 I

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

1.2 研究现状及问题分析 1

1.3各种测定分析方法及应用前景 2

1.3.1 实时荧光定量PCR检测技术 2

1.3.2.多重微滴式数字聚合酶链式反应技术 3

1.3.3 高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法 3

1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 4

1.3.5 显微近红外光谱分析技术 4

1.4研究的目的及意义 4

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1实验样品 6

2.1.2 主要实验试剂 7

2.1.3 实验仪器 7

2.2 实验方法 7

2.2.1 样品DNA提取 8

2.2.2 样品DNA浓度及纯度的测定 8

2.2.3实时荧光PCR扩增 8

2.2.4 特异性分析 9

2.2.5 灵敏性分析 9

2.2.6 平行对照试验 10

第三章 结果与对市售样品的分析 11

3.1 样品DNA浓度及纯度的测定 11

3.2 实时荧光PCR方法对样品中植物源性成分的分析 11

3.2.1实时荧光PCR特异性分析 11

3.2.2方法灵敏度检测结果 12

3.2.3对样品中植物源性成分的分析 13

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致 谢 18

第一章 文献综述

1.1研究背景

21世纪以来，社会不断发展进步，人们生活水平不断提高，随着食品市场逐步扩大，精加工、深加工食品在市场上占据越来越大的比重，俨然已经成为人们生活中重要的一部分。但是这些食品通过加工层层技术，失去了原有的口味和外观，而普通消费者无法直接判断食品是否含有包装标识成分，所以，开发研究出一种方便快捷、高速有效的检测方法显得尤为重要，通过该方法快速准确地对食物成分进行分析检查，更大程度地保障广大消费者的权益。

其中，植物蛋白饮料具有“天然、营养、健康、绿色、环保”等一系列特征，再加上口感良好，既迎合年轻人口味，又能被中老年人接受，符合饮料市场发展趋势和潮流，因此已经在饮料市场占有一席之地。随着原料价格的上涨，市场需求的增加，部分生产企业为了减少生产成本，获得更多利润，滥竽充数、以次充好现象层出不穷，鱼目混珠、掺假混假问题日益严重，例如用廉价的植物蛋白粉来代替植物源原料，并且添加过量的添加剂，甚至用味道相似但价格低廉的非标识成分来替代原料成分，这些情况都是令人发指的，都从一定程度上危害人健康，而目前食品安全监测检验机构并不具备完善成熟的定性检测分析的方法体系，这就导致植物蛋白饮料掺假造假问一度成为食品行业监管难题^[1]。

1.2 研究现状及问题分析

目前，我国还处于社会发展初级阶段，与发达国家相比我们的食品安全存在很多漏洞。随着近几年社会关注度的不断提高，人们越来越注重食品安全卫生状况，因此，食品包装所标识的原料成分是否存在即原料真实性检验既关乎到食品标签管理的规范性，也是食品监管和质量控制的重要步骤之一。

关于食品中掺杂使假鉴定方法，通过查询文献可知，被记载较多的有多重微滴式数字聚合酶链式反应技术、高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法以及显微近红外光谱分析技术，除此之外，蛋白质电泳技术、色谱质谱技术、免疫学技术、分子生物学检测技术^[2]都可以作为食品成分检测的手段，但是这些技术预处理复杂、操作步骤繁琐、灵敏度不高甚至有试剂毒性危害，难以作为主要检测技术在实际市场进行推广应用。但是目前研究中基于DNA的检测方法可以克服以上弊端，具有操作简单方便，结果快速准确等优点，其中其中实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术（下文简称为实时荧光PCR检测法）^[3]以其快速准确、灵敏度高、特异性强等一系列优点，成为食品安全检测的重要研究手段。因此本次实验所采用的研究方法为实时荧光PCR检测法。

1.3各种测定分析方法及应用前景

1.3.1 实时荧光定量PCR检测技术

实时荧光定量多聚核苷酸链式反应^[4]（Quantitative Real-time PCR）是指将荧光基团加入到PCR反应体系中，使用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其操作原理是在PCR扩增过程中添加一对引物，同时添加特定的荧光探针—核苷酸，与此同时报道荧光基团和猝灭剂荧光基团在两端被标记。如果探针是完整的，由报道基团发射的荧光信号将会被猝灭剂基团吸收，之后任何单链DNA都可能与探针结合上，并且当PCR扩增时，Taq酶位于5'端-3'端的探针酶被外切酶降解，淬灭荧光基团和报告荧光基团因此分离从而荧光监测系统可以接收荧光信号。也就是说，对于每条扩增的DNA链，形成一个荧光分子。荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步。随着PCR的进展，越来越多的SYBR染料被结合起来，仪器检测到的荧光信号也因此变得越来越强，定量分析的目的就达到了。