摘 要

四氢嘧啶是一种渗透压补偿溶质，普遍存在于嗜盐和耐盐微生物中，是一种氨基酸衍生物，分子式为C₆H₁₀N₂O₂。四氢嘧啶具有广阔的应用前景和巨大的应用价值，因为其应用十分广泛，涉及生物大分子和细胞保护剂、生物制剂稳定剂、药物制剂和化妆品添加剂等领域，商业附加值高。但目前能用于工业化生产四氢嘧啶的菌种较少，且产量较低，因此本课题本论文首先从土壤中分离提纯得到耐盐菌，然后进行发酵培养获得一株四氢嘧啶合成能力较强的菌株，用液相色谱法分析其胞内四氢嘧啶，结果显示6.680min有吸收峰，与标准品出峰时间（6.4-6.7min）相一致。将其进行16S rDNA序列分析比对。测序结果与序列库中Halomonas.sp.BYS-1 的基因序列同源性相似度99%，初步将目的菌株鉴定为盐单胞菌，将其命名为Halomonas.sp.NZH-1，并进行后续实验。培养条件优化实验依次考察了碳源种类及浓度、NaCl浓度、氮源种类及浓度、接种量对四氢嘧啶合成的影响，通过对实验数据的分析，优化后的培养条件为：最优碳源及浓度为L-谷氨酸钠 35g/L，最佳盐浓度为NaCl 1.5mol/L ，最优氮源及浓度为酵母粉7g/L，最优接种量为1%。

关键词：四氢嘧啶，菌种筛选，发酵条件优化

Abstract

Ectoine is an osmotic pressure-compensated solute , commonly found in halophilic and salt-tolerant microorganisms. It is an amino acid derivative with the molecular formula C6H10N2O2. Ectoine has broad application prospects and huge application value because of its wide application, involving biomacromolecules and cell protection agents, biological agent stabilizers, pharmaceutical preparations, and cosmetic additives, etc., with high commercial added value . However, there are few strains that can be used for industrial production of Ectoine, and the yield is low. Therefore, this paper firstly separates and purifies the salt-tolerant bacteria from the soil, and then conducts fermentation culture to obtain a Ectoine synthetic ability. Strong strains were analyzed for their intracellular ectoine by liquid chromatography. The results showed that there was an absorption peak at 6.680 min, which was consistent with the standard peak time (6.4-6.7 min). It was aligned with 16S rDNA sequence analysis. The sequence similarity was 99% similar to that of Halomonas sp. BYS-1 in the sequence library . The target strain was initially identified as Halomonas, which was named Halomonas.sp.NZH-1. And follow-up experiments. Optimization of culture conditions The effects of carbon source type and concentration, NaCl concentration, nitrogen source type and concentration, and inoculum size on the synthesis of Ectoine were examined in turn. Through analysis of the experimental data, the optimized culture conditions were as follows: optimal carbon source And the concentration of L-glutamic acid sodium 35g / L, the best salt concentration of NaCl 1.5mol / L, the optimal nitrogen source and concentration of yeast powder 7g / L, the optimal inoculum size of 1%.

Key words：Ectoine, Halophilic bacteria, Fermentation optimization

目录

摘要................................................................................................................................Ⅰ

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 四氢嘧啶的理化性质 1

1.3 四氢嘧啶的应用 1

1.3.1 酶、蛋白质和核酸等生物大分子的保护剂 2

1.3.2细胞保护剂 2

1.3.3药物制剂 2

1.3.4 化妆品添加剂 2

1.4四氢嘧啶生产菌的筛选及培养条件优化的研究意义 3

第二章实验材料与方法 4

2.1实验材料 4

2.1.1主要实验仪器 4

2.1.2主要实验试剂 5

2.1.3菌株 5

2.1.4培养基 6

2.1.5 培养方法 6

2.2实验方法 6

2.2.1耐盐菌株的分离 6

2.2.2四氢嘧啶合成菌株的筛选 7

2.2.3目的菌株的形态学鉴定 7

2.2.4目的菌株的基因组DNA的提取 7

2.2.5 PCR扩增细菌16S rDNA序列 7

2.2.6琼脂糖凝胶电泳检测 8

2.3分析方法 9

2.3.1 16SrDNA序列分析 9

2.3.2产Ectoine能力鉴定 10

2.3.3生物量测定 10

2.3.4细胞干重测定 10

2.3.5胞内四氢嘧啶测定 10

第三章 结果与讨论 11

3.1四氢嘧啶生产菌株筛选与鉴定结果 11

3.1.1目的菌株筛选结果 11

3.1.2目的菌株的形态学分析 11

3.1.3目的菌株的序列测定与分析 12

3.2碳源种类优化 14

3.2.1结果 14

3.3.2讨论 15

3.3碳源浓度优化 16

3.3.1结果 16

3.3.2讨论 16

3.4氮源种类对四氢嘧啶合成的影响 17

3.5氮源浓度对四氢嘧啶发酵生产的影响 18

3.6NaCl浓度对四氢嘧啶合成的影响 19

3.6.1结果 19

3.6.2讨论 20

3.7接种量对发酵的影响 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致谢 26

第一章 文献综述

1.1 前言

四氢嘧啶在生物大分子和细胞保护剂、生物制剂稳定剂、药物制剂和化妆品添加剂等领域具有很大的应用价值和广泛的应用前景^[1]。但是四氢嘧啶作为中度嗜盐菌的胞内产物，具有产量低，分离提取成本较的问题，因此其推广和应用受到了严重制约。因此，在过去的几十年里，科研人员和生产企业致力于通过菌株筛选和生产工艺改进来提高四氢嘧啶的产量^[2-3]。本论文对四氢嘧啶生产菌株进行筛选，并优化其培养条件，希望能为实现四氢嘧啶的产业化提供少许理论基础。

1.2 四氢嘧啶的理化性质

四氢嘧啶是一种渗透压补偿溶质，广泛存在于中度嗜盐菌中，如盐单胞菌，芽孢杆菌，链霉菌等^[4]。在1985年，Galinski等人首次在嗜盐外硫红螺菌中发现并鉴定其结构^[5]。四氢嘧啶是一种环状的氨基酸衍生物，分子式为C₆H₁₀N₂O₂，分子量142 g/mol，熔点280℃。四氢嘧啶易在水中溶解，其溶解度为550g/L（25℃），微溶于甲醇、乙醇，并pH1-9条件下具有稳定性质^[6]。

1.3 四氢嘧啶的应用

四氢嘧啶作为渗透压补偿溶质，由于具有分子量小、溶解度高、生理pH条件下不带电荷、亲水性等特点，因而能够在细胞内高浓度积累，对细胞内正常的代谢活动没有干扰^[7-9]。四氢嘧啶可广泛应用于生物大分子和细胞保护剂、生物制剂稳定剂、药物制剂和化妆品添加剂等领域，具有广阔的应用前景和巨大的应用价值，商业附加值高^[10]。

1.3.1 酶、蛋白质和核酸等生物大分子的保护剂

研究表明，四氢嘧啶可以保护酶、DNA和细胞膜等生物大分子，从而在外界环境改变时，帮助以上物质免受损伤。四氢嘧啶在作为酶制剂抵御外界不良环境的保护剂时，表现十分优越，具体情况已在多篇文献中报道过^[11-14]。如Lippert等人就曾经报道过在过热或过冷的极端反应条件下，四氢嘧啶能将乳酸脱氢酶和磷酸果糖激酶的半衰减温度提高5℃，从而扩大这两种酶的温度应用范围^[15-18]。

1.3.2细胞保护剂

四氢嘧啶在逆环境中对细胞具有一定的保护作用。据报道，四氢嘧啶能够增强E.coli在空气干燥和冷冻干燥条件下的稳定性。通过在培养基中添加四氢嘧啶的方法，渗透压胁迫对大肠杆菌生长的抑制程度可以被大幅度削弱。据报道，四氢嘧啶可以隔离有毒的、带有多聚谷氨酸盐长链的错误折叠蛋白，防止其转移到细胞核内，对细胞遗传物质造成影响。四氢嘧啶能一定程度上减缓细胞调亡^[19-20]。

1.3.3药物制剂

在医药制剂方面，蛋白质错误折叠是导致艾兹海默症、海绵状脑病以及胰岛素病变的糖尿病等疾病的重要原因之一，而四氢嘧啶可以具有类似蛋白伴侣的作用，从而抑制蛋白聚合体的形成^[21]。四氢嘧啶具有一个的手性碳结构，能够在恶性肿瘤化疗治疗中作为一种优良的保护剂保护健康的细胞不受化疗的破坏^[22]。

1.3.4 化妆品添加剂

四氢嘧啶能够保护细胞膜免受表面活性剂引起的损伤，并且具有良好的锁水功能，因此可作为化妆品中的保湿剂。四氢嘧啶还能够一定程度上有效保护皮肤，减轻紫外线对其产生的伤害。除此之外，四氢嘧啶还作为皮肤细胞中蛋白质的“保护伞”，阻止皮肤水分的流失，从而对过敏性皮肤起到保湿的作用。德国默克公司已经成功研发并生产了添加了四氢嘧啶的化妆品，并取得可观的市场和收益，说明四氢嘧啶在化妆品行业的巨大市场前景^[23]。

1.4四氢嘧啶生产菌的筛选及培养条件优化的研究意义

在菌株筛选方面,已经报道的可用来研究四氢嘧啶合成的菌株有放线多胞属，短杆菌属，芽孢杆菌属，假单胞菌属，盐单胞菌属。但由于四氢嘧啶作为渗透压补偿溶质，主要存在于嗜盐和耐盐微生物中，而且能用于工业化生产的菌种不多，因此本课题将对中度嗜盐菌进行筛选，得到四氢嘧啶产量较高的菌株。

四氢嘧啶作为酶等分子试剂保护剂、功能性化妆品添加剂以及在医药健康等方面的应用，具有非常大的价值和市场。但是四氢嘧啶作为中度嗜盐菌的一种胞内产物,普遍具有产量较低,分离纯化难，生产成本较高的问题 ,严重限制了它的发展和应用^]。因此本课题着眼于产量问题，对四氢嘧啶生产菌进行筛选，并对筛选获得的具有较高四氢嘧啶合成能力的菌株进行进一步的培养条件优化，以期提高四氢嘧啶产量，为实现工业化生产做出一定的指导。

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要实验仪器

表2-1实验仪器

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