论文总字数：16021字

摘 要

现如今，随着生物科技的高速发展，羟化酶的运用得到了人们的重视。四氢嘧啶类物质（Ects）由于对细胞的保护作用很好，所以广泛应用在生物医学上，如帕金森氏病，海绵状脑病等神经系统疾病。此外，四氢嘧啶类物质在化妆品，生物制造，环保等领域也有广阔的前景。羟基四氢嘧啶（Ectoine），是一种相容性溶质，与别的同类物质相比，则显示出它在平衡渗透压和保护蛋白质方面有着更好的作用。四氢嘧啶羟化酶（EctD）在催化反应中，将四氢嘧啶作为底物，将二价铁离子和α-酮戊二酸作为辅底物，从而制备产物羟基四氢嘧啶。它是微生物法制备羟基四氢嘧啶过程中的关键酶，因此四氢嘧啶羟化酶，跟羟基四氢嘧啶一样，都受到了行业中人们极大的关注。本课题将从四氢嘧啶羟化酶重组菌发酵液中，纯化得到四氢嘧啶羟化酶纯酶，对四氢嘧啶羟化酶在酶学方面的性能，开展初步考察与实验，内容涵盖了最适pH、pH稳定性、最适温度以及温度稳定性，以及金属离子对四氢嘧啶羟化酶催化性质的影响，最后测定了该酶的动力学参数。本研究为利用四氢嘧啶羟化酶，高效催化制备羟基四氢嘧啶，奠定了理论基础。

关键词：羟基四氢嘧啶；四氢嘧啶羟化酶；酶学性质

Purification and properties of Ectoine hydroxylase

Abstract

Today, owing to the rapid development of biotechnology, the use of hydroxylase has attracted people's attention. Ectoines (Ects) have a good protective effect on cells, and are widely used in biomedicine, such as Parkinson's disease, spongiform encephalopathy and other neurological diseases. Apart from this, ectiones also has spacious prospects in the fields of in cosmetics, biological manufacturing, environmental protection. 5-hydroxyectoine (5-HE) is a compatible substance. Compared with other ectiones, it has a better balance in balancing osmotic pressure and protecting proteins. Ectoine hydroxylase (EctD), which can catalyze ectione to prepare 5-hydroxyectoine with Fe² and α-ketoglutarate as auxiliary substrates, is the key to the production of 5-hydroxyectoine in microbial catalytic fermentation Enzyme, so 5-hydroxyectoine and ectoine hydroxylase have received great attention. This topic will be purified from the fermentation broth of recombinant ectoine hydroxylase to obtain pure enzyme of ectoine hydroxylase, and conduct a preliminary study on the enzymatic properties of ectoine hydroxylase. The content covers the optimal pH and pH stability, optimal temperature and temperature stability, and the effect of metal ions on ectoine hydroxylase, and finally determining the kinetic parameters of the enzyme. This study laid a theoretical foundation for the efficient catalytic preparation of 5-hydroxyectoine using ectoine hydroxylase.

KEYWORDS: 5-hydroxyectoine；ectoine hydroxylase；enzymatic properties

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 研究的背景和意义 1

1.2 四氢嘧啶羟化酶的简介 1

1.3 EctD的催化反应机理 2

1.4 国内外研究现状及发展趋势 2

1.5 EctD的性质及应用 3

1.6 本研究的目的与意义 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料与设备 5

2.1.1 菌株 5

2.1.2 主要试剂 5

2.1.3 仪器设备 5

2.1.4 培养基 6

2.2 实验方法 7

2.2.1四氢嘧啶羟化酶的纯化 7

2.2.2 四氢嘧啶羟化酶的活性测定 8

2.2.3 温度对四氢嘧啶羟化酶的影响 8

2.2.4 pH对四氢嘧啶羟化酶的影响 8

2.2.5 金属离子对四氢嘧啶羟化酶的影响 8

2.2.6 四氢嘧啶羟化酶的动力学参数测定 8

第三章 结果与讨论 9

3.1 EctD的分离纯化 9

3.2 酶学性质的分析 9

3.2.1 四氢嘧啶羟化酶的最适温度及温度稳定性 9

3.2.2 四氢嘧啶羟化酶的最适pH及pH稳定性 10

3.2.3 金属离子对四氢嘧啶羟化酶的影响 10

3.2.4 四氢嘧啶羟化酶的动力学参数 11

3.3 讨论 12

第四章 展望 13

参考文献 14

致 谢 17

第一章 绪论

1.1 研究的背景和意义

四氢嘧啶类物质^[1]（Ectoines，Ects），属于相溶性溶质，是耐盐或嗜盐细菌在细胞中合成的，可帮助细胞抵抗外部高盐胁迫。其中最具有代表性的，就是四氢嘧啶（Ectoine），以及它的衍生物——羟基四氢嘧啶（5-hydroxyectoine）。众所周知，四氢嘧啶类物质，不仅可以给予细胞一定的抗逆协助^[2]，也可以平衡细胞渗透压，使细胞能够在极端条件下生存。但又因为四氢嘧啶类物质的结构中含有手性碳，导致化学合成四氢嘧啶类物质较为困难，所以利用微生物发酵来制备四氢嘧啶类物质的方法得到了越来越多的关注。关于如何改进生产四氢嘧啶类物质方法的实验，主要集中在相关菌株的抉择及生产工艺两个方面^[3]。

现有技术中，大部分羟基四氢嘧啶，都是依赖盐单胞菌进行生产的^[4][5]。有学者通过实验了解到，嗜盐菌（Halomonas ventosae DL7）是一个不错的选择，可以用来制备羟基四氢嘧啶^[6]，然而上述发酵法暴露出许多不足之处：（1）热刺激诱导的方式，合成羟基四氢嘧啶，即在实验过程中需要把温度提高。不过，温度被提升上去的同时，嗜盐菌也会受到影响甚至停止生长，这意味着不能产生四氢嘧啶，自然也无法合成羟基四氢嘧啶；（2）不可避免地，培养基之内一定会在同一时间，既存在Ectoine，又含有5-hydroxyectoine。加上两者性质相似，导致分离和纯化羟基四氢嘧啶的工艺更加困难。 综上所述，现有的发酵方法因为生产方式不够经济节约，控制过程复杂，分离纯化困难，所以不具有工业化模式生产的可行性。

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