论文总字数：19522字

摘 要

鱼类在商业市场上的错误标记和替代已经在世界各地被广泛报道，且报道揭示了其与经济损失、健康问题甚至海洋枯竭等有关的后果。大西洋鲑鱼（Salmo salar）是最受欢迎的鲑鱼品种之一，也深陷于物种标签错误的丑闻。为了防止这一现象的发生，本研究旨在建立一种以线粒体细胞色素b（cytb）基因为靶点的实时荧光环介导等温扩增（LAMP）法，用于快速检测加工鱼制品中的大西洋三文鱼。结果发现，新建立的检测方法只需大西洋三文鱼DNA 5 pg便可检测到，而且与非目标物种没有交叉反应。此外，实时荧光LAMP法成功地被应用到商业化的三文鱼产品中，应用结果显示在检测的30份产品中仅6种产品含有大西洋三文鱼（20%）。因此，该方法具有良好的灵敏度和特异性，可用于商业鱼产品中大西洋三文鱼的检测。

关键词：大西洋三文鱼 实时荧光定量PCR 物种鉴定 物种掺假

Rapid detection of Atlantic salmon by real-time fluorescent LAMP

Abstract

Fish species mislabeling and substitution in the commercial market has been widely reported around the world and the consequences related to financial loss, health concern and even marine depletion have been revealed. Atlantic salmon (Salmo salar) represents one of the most appreciated salmonid species and is also deep in the scandal of species mislabeling. To help prevent this episode, the present study aimed to develop a real time fluorescence loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay targeting the mitochondrial cytochrome b (cytb) gene for rapid detection of S. salar in processed fish products. Results found that using the novel assay, as little as 5 pg of S. salar DNA could be detected, without any cross-reactivity with non-target species. Moreover, the real time fluorescence LAMP assay was successfully applied to commercially San Wen Yu products, and the presence of S. salar was revealed in only six products (6/30, 20%). Therefore, the novel approach has excellent sensitivity and specificity in the detection of S salar and can be used to monitor S. salar presence in commercial fish products.

Key words: Atlantic salmon real time fluorescence quantitative PCR species identification species adulteration

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1大西洋三文鱼（Salmo salar）简介 1

1.2 水产品品种掺假 3

1.3 基于DNA的检测方法 4

1.3.1 聚合酶链式反应（PCR） 4

1.3.2 等温扩增 6

1.4 目的意义 9

第二章 实验材料与方法 10

2.1 实验材料 10

2.1.1 样品 10

2.1.2 试剂 10

2.1.3 仪器和设备 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 样品DNA提取 11

2.2.2 引物设计 11

2.2.3 实时荧光LAMP反应体系的建立与优化 11

2.2.4 实时荧光LAMP法检测三文鱼样品 12

第三章 结果与分析 13

3.1 Mg² 对实时LAMP体系的影响 13

3.2外引物（F3/B3）对实时LAMP体系的影响 13

3.3内引物（FIP/BIP）对实时LAMP体系的影响 14

3.4 dNTP对实时LAMP体系的影响 14

3.5 ThermoPol缓冲液对实时LAMP体系的影响 15

3.6 SYBR Green I染料对实时LAMP体系的影响 16

3.7 样本检测 16

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致谢 22

文献综述

1.1大西洋三文鱼（Salmo salar）简介

大西洋三文鱼是一种生活在海水中的冷水性鱼类，属鲑形目（Salmoniformes）、鲑属（Salmo）。据统计，现今世界上的三文鱼种类共有66种^[1]。其中鲑形目的主要品种及其在2016、2017两年中的相应产量见表1-2。

表1-1 主要鲑形目品种2016和2017年产量（单位：百万吨）

注：数据来自于http://www.fao.org/fishery/statistics/global-production/en.

大西洋三文鱼主要产于北冰洋与大西洋、太平洋的交界水域，其适盐性广，在海水、淡水、咸淡水中均能存活。世界大西洋三文鱼生产集中，主要从挪威、智利、俄罗斯、美国和日本等国家出产。其中出产大西洋三文鱼品质高的国家要数挪威和加拿大，这两个国家都盛产海产品，而且所出产的海产品品类多、数额大。然而，世界上水产养殖最大的国家是中国，根据相关报道称：在2016年时，中国的三文鱼总产量仅达挪威2009年养殖产量的4.44%^[2]，其三文鱼产业发展水平还远落后。二十世纪以来，世界天然大西洋三文鱼的产量正随着生态环境的变化和捕捞量的增加逐年锐减，随即人工养殖顺势兴起。1996年世界三文鱼养殖产量首次超过捕捞量^[3]。我国在人工繁殖和集约化养殖等方面也有所成效。

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