论文总字数：17858字

摘 要

褐藻胶（Alginate）是一种由巨藻、海带和马尾藻等褐藻中提取而得的高聚合度的酸性多糖，是细胞壁的主要组成物质^[1]。目前，褐藻胶被广泛应用在食品、医药、日用化工和农业等领域，然而分子量较大，不易被机体吸收，使其进一步的应用受到限制，褐藻胶寡糖是褐藻胶经过降解而得到的一种低分子聚合物，具有溶解性好、稳定性强、易被吸收等优点，因此褐藻胶裂解酶的固定化对于推动褐藻寡糖酶法制取在工业上的应用意义深远。

本论文涉及一种对内切型褐藻胶裂解酶AlyPL6的克隆表达，酶学性质表征以及固定化。具体为对Pedobacter hainanensis NJ-02中的褐藻胶裂解酶AlyPL6克隆表达。将AlyPL6的基因克隆转化到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达相应的褐藻胶裂解酶。酶学性质表征结果表明，该酶最适温度为45℃，最适pH为10.0，并且该酶拥有较高的比活力。用介孔二氧化钛对其进行固定化之后，该酶的温度稳定性以及使用性能都有了较大的提升。本论文对发掘新型褐藻胶裂解酶以及酶固定化具有极大参考价值，且所获得的固定化酶AlyPL6可作为生产制备褐藻胶寡糖的潜在工具。

关键词:褐藻胶裂解酶、克隆表达、固定化酶、酶学性质表达

Abstract

Alginate is an acidic polysaccharide with high degree of polymerization extracted from brown algae such as macroalgae, kelp and Sargassum, which is the main component of cell wall. Alginate oligosaccharide is a low molecular polymer obtained by alginate degradation. Therefore, the immobilization of alginate lyase on alginate oligosaccharide It is of far-reaching significance to promote the industrial application of brown algae oligosaccharide enzymatic preparation.

The paper deals with the cloning, expression, characterization of enzymatic properties and immobilization of endo-alginate lyase AlyPL6. Specifically, we cloned and expressed alginate lyase AlyPL6 from Pedobacter hainanensis NJ-02. AlyPL6 gene was cloned and transformed into E. coli expression vector to obtain recombinant E. coli strain with heterologous expression. The corresponding alginate lyase was expressed heterologously with the strain. Characterization of enzymatic properties showed that the optimum temperature and pH of the enzyme were 45℃ and 10.0, and the enzyme had high specific activity. The invention has great reference value for discovering new alginate lyase and immobilization of enzyme, and the obtained immobilized enzyme AlyPL6 can be used as a potential tool for producing alginate oligosaccharides.

Key words：Alginate lyase, clonal expression, immobilized enzyme and enzymatic properties expression

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1褐藻胶及褐藻胶寡糖概况 1

1.2褐藻胶寡糖的制备 1

1.2.1 物理降解法 1

1.2.2 化学降解法 1

1.2.3 酶降解法 2

1.3 酶固定化 2

1.3.1 酶固定化方法 3

1.3.2 固定化酶的应用 4

1.4 研究问题与手段 4

第二章 实验材料及方法 5

2.1 材料及药品 5

2.2 主要仪器 6

2.3实验方法 6

2.3.1 菌株Pedobacter hainanensis NJ-02的培养与基因组提取 6

2.3.2 AlyPL6的提取 7

2.3.3褐藻胶裂解酶AlyPL6重组表达载体构建以及相应表达纯化 7

2.3.4褐藻胶裂解酶AlyPL6酶学性质分析 8

2.3.5 AlyPL6的固定化 9

第三章 结果与分析 10

3.1褐藻胶裂解.酶AlyPL6重组表达载体构建以及相应表达纯化 10

3.2 褐藻胶裂解酶AlyPL6克隆表达酶学性质 10

3.2.1 温度对酶活性及稳定性的影响 10

3.2.2 pH对酶稳定性的影响 11

3.2.3 AlyPL6的酶活性及动力学 12

3.2.4金属离子对AlyPL6活性的影响 13

3.3 酶的固定化 13

3.3.1固定化酶与游离酶温度稳定性比较 13

3.3.2 固定化酶操作稳定性 14

第四章 总结与展望 15

4.1 总结 15

4.2 应用展望 15

参考文献 16

致谢 19

第一章 前言

1.1褐藻胶及褐藻胶寡糖概况

褐藻胶（Alginate）是一种由巨藻、海带和马尾藻等褐藻中提取而得的高聚合度的酸性多糖，是细胞壁的主要组成物质^[1]。褐藻胶是由β-D-聚甘露糖醛酸（M）和α-L-聚古罗糖醛酸（G）通过1→4糖苷键连接而成的直链多糖^[2]。目前，褐藻胶被广泛应用在食品、医药、日用化工和农业等领域^[3]，然而仍存在一些不足：分子量较大，分子质量范围一般在104~106 U，凝胶性强，黏度大，不易被机体吸收等，使其进一步的应用受到限制^[4]。褐藻胶寡糖是褐藻胶经过降解而得到的一种低分子聚合物，具有溶解性好、稳定性强、易被吸收等优点，能有效克服褐藻胶的多种不足，其生物活性更为突出，如促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等方面，应用前景广阔。因此，褐藻胶寡糖的制备方法及其生物活性的研究已成为国内外学者研究的新热点，其研究为褐藻胶寡糖等相关产品的利用与开发提供科学依据。

1.2褐藻胶寡糖的制备

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