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摘 要

褐藻胶酶法水解生产的褐藻胶寡糖具有反应条件优异，凝胶性能优良，产物便于纯化等这些优点，接受到越来越多的注意力。但是却没有太多的商业酶。目前从刚分离的海洋菌株Cellulophaga sp中分离提纯了高活性（24,038U / mg)的新型褐藻胶裂解酶NJ-1。这种酶的最适温度与ph为50℃和pH8.0，并且在其他温度（40℃以下）pH6.0~10.0范围内，仍能有较高的保持稳定的能力。对褐藻胶的杂聚物MG嵌段（polyMG），和均聚物G嵌段（polyG）均聚物M嵌段（ polyM）都有一定影响，并且对均聚G（15.63mM）以及杂聚MG（23.90mM），均聚M（53.61mM）和褐藻胶（28.73mm）具有一些高的贴合性。并且水解产物的TLC和MS光谱分析都证明了这种酶可以把褐藻胶充分水解成低聚合度（低DP）的寡糖。这种性能上的优异性使它可以培养成用褐藻胶生产寡糖的一种富有前景的工具。

关键词：褐藻胶裂解酶;噬纤维素菌; 酶促水解;寡糖

Enzymatic Hydrolysis of Alginate to Produce Oligosaccharides by a New Purified Endo-Type Alginate Lyase

ABSTRACT

Enzymatic hydrolysis of sodium alginate to produce alginate oligosaccharides has drawn increasing attention due to its advantages of containing a wild reaction condition, excellent gel properties and specific products easy for purification. However, the efficient commercial enzyme tools are rarely available. A new alginate lyase with high activity (24,038 U/mg) has been purified from a newly isolated marine strain, Cellulophaga sp. NJ-1. The enzyme was most active at 50 C and pH 8.0 and maintained stability at a broad pH range (6.0–10.0) and temperature below 40 C. It had broad substrate specificity toward sodium alginate, heteropolymeric MG blocks (polyMG), homopolymeric M blocks (polyM) and homopolymeric G blocks (polyG), and possessed higher affinity toward polyG (15.63 mM) as well as polyMG (23.90 mM) than polyM (53.61 mM) and sodium alginate (27.21 mM). The TLC and MS spectroscopy analysis of degradation products suggested that it completely hydrolyzed sodium alginate into oligosaccharides of low degrees of polymerization (DPs). The excellent properties would make it a promising tool for full use of sodium alginate to produce oligosaccharides.

Keywords ：Alginate lyase； Cellulophaga; enzymatic hydrolysis; oligosaccharide

目录

第一章 前言 1

1.1褐藻胶概述及简介 1

1.1.1 褐藻胶概述 1

1.1.2 褐藻胶寡糖简介及其应用 1

1.1.3褐藻胶寡糖的酶法制备的原理和前景 1

1.1.4本课题研究的内容及意义 2

第二章 实验材料与方法 3

2.1实验材料 3

2.2实验步骤 3

2.2.1酶品种分离和鉴定 3

2.2.2酶的纯化 4

2.2.3 测定裂解酶活性的值和蛋白质浓度 4

2.2.4 NJ-1的底物专一性的酶学动力参数 4

2.2.5 NJ-1的生化特点 4

2.2.6酶的作用方式和底物结合分析 5

2.2.7褐藻胶酶法水解 5

2.2.8酶的降解产物的ESI-MS分析 5

第三章 结果与讨论 6

3.1 产生褐藻胶裂解酶的微生物 6

3.2 提纯褐藻胶裂解酶 6

3.3 褐藻胶裂解酶的底物特异性和动力学参数 7

3.4酶的生物化学性质 8

3.4.1温度和pH对酶活性和稳定性的影响 8

3.4.2 金属离子对酶活性的影响 10

3.5酶的作用方式和底物结合位点 10

3.6 利用Cel32催化水解新化合物的研究 11

3.7 Cel32降解产物的ESI-MS分析 11

第四章 结论与展望 13

4.1 结论 13

4.2 展望 13

参考文献 14

致 谢 19

第一章 前言

1.1褐藻胶概述及简介

1.1.1褐藻胶简介

褐藻胶是通过1,4号键连接的D型甘露糖醛酸（M）及其碳5差向异构-L型古洛糖醛酸（G）结合成的线性结构酸性多糖[1]。这些糖醛酸残基被分为均聚物M链聚合（polyM）、均聚物G链聚合(polyG)，杂聚MG链嵌段(polyMG)[1]。估计年产大约3万吨褐藻胶，估计不到生物合成褐藻胶总量的10％[2],因此，褐藻胶未来很有机会成为丰富的生物资源材料。褐藻胶同时也已经是某些食品药品的重要来源。它具有很多的物理活性，比如如抗肿瘤的形成[3,4]、免疫调节[5,6]以及促进生长的功效[7]。它还参与并修复皮肤的损伤[8]以及细胞和酶成分的固定[9]，但是褐藻胶在医学中的应用还没有完全利用，主要因为凝胶化难度的限制。

1.1.2 褐藻胶寡糖简介及其应用

褐藻胶的酶法水解产物便是褐藻胶寡糖，因为它具备显著的生物活性，明显的凝胶特性和出色的溶解性，和良好的人体吸收性，吸引了越来越多的注意力。这种寡糖可以用于医药，如植物性治疗药物，抗凝剂和促肿瘤抑制剂生长的正向促进剂[10]。同时这些寡糖还可以促进诱使细胞因子的产生，稳定血糖血脂[11]。因此，通过酶法反应制备褐藻胶寡糖在长时间范围内是这个领域的重点。

1.1.3褐藻胶寡糖的酶法制备的原理和前景

褐藻胶可以通过褐藻胶裂解酶断裂β-葡萄糖苷键使其水解为寡糖，同时在非非还原性末端产生不饱和双键[12]。目前已经鉴定了大多数裂解酶，并克隆分析了它们的DNA。由于它们具有不相同的底物特异性，它们可分为两类：一个是G链特异性裂解酶（polyG 裂解酶），与他并列的是M链特异性裂解酶（polyM 裂解酶），但是有一部分另外的酶能同时表现出对均聚物M链聚合（polyM）、均聚物G链聚合(polyG)活性[13-18]，这些酶可能也能更加高效地降解褐藻胶。从反应方式来说，褐藻胶裂解酶可以被分成内切性和溶解性裂解酶[12]。内切型褐藻胶裂解酶剪断褐藻胶内的糖苷键并产生其中的不饱和低聚合度糖（二糖，三糖和四糖）作为大部分的生成物[19]，而溶解性褐藻胶裂解酶可以百尺竿头更进一步的将寡糖从非还原性末端降解成单体[ 20-22]。目前的褐藻胶裂解酶，尤其是以内切型裂解酶为主，已经广泛的应用在生产褐藻胶寡糖当中[23]，褐藻胶细微结构的研究[24]以及制备红藻和褐藻等多种藻类的原生质体[25,26]。另外褐藻胶裂解酶还可以用来治疗囊性纤维化[27]。正是考虑到目前仍缺乏具有优良特性的商品酶，因此，制备具有高活性和广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶是非常急需的。在这项实验工作中，从海洋细菌Cellulophaga sp中提取的 NJ-1就是一种新的褐藻胶裂解酶，它具有比较宽的底物特异性。对水解出来的寡糖进行动力参数研究和分析，证明了它有机会当选展开褐藻胶裂解酶的宽广前景的潜在备用酶。

1.1.4本课题研究的内容及意义

本实验大致探究了褐藻胶裂解酶对褐藻胶寡糖制备的原理及产物分析，测定了酶活性、酶的底物特异性以及他的其他生化特性，并研究分析了他的酶促产物，研究并标示了该酶作为商业用途里生产褐藻胶寡糖的可行性和前景！

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

(1) 菌种：本研究中使用的藻酸盐降解菌株是从黄海腐烂的海藻中分离得到的。

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