论文总字数：23074字

摘 要

海洋多糖降解酶在海洋中起着重要作用，比如在藻类降解和碳循环方面，新型褐藻胶裂解酶发挥了及其突出的作用，虽然很多现象已经表征了新型褐藻胶裂解酶是具有工业潜力的酶，但这仍然是相当罕见的。编码新型褐藻胶裂解酶AlgNJ04的基因我们已经从海洋细菌Vibrio sp NJ04中克隆出来。重组新型褐藻胶裂解酶的特点是其可以在Ni-NTA琼脂糖凝胶上纯化，它在pH为7.0和温度为40°C时表现出最佳活性（2416U / mg）。值得注意的是，AlgNJ04在pH值为4.0和10.0广泛的范围内保留了80％以上的最大活性，表现出优异的pH稳定性。另外实验结果表明新型褐藻胶裂解酶对β-D-甘露糖醛酸酯（polyM）和聚α-L-古洛糖醛酸酯（polyG）具有更加广泛的底物特异性。此外，通过对该酶的酶动力学参数进行测定，得出AlgN04对海藻酸（0.49mM）和polyG（0.24mM）的抑制作用低于此条件下的polyM（0.86mM）。值得注意的是，AlgNJ-04的活性可以被具有一定浓度的NaCl活化，这部分是由去除结合水引起的藻酸钠分子或通过形成新型褐藻胶 - 酶的电荷复杂作用引起的。 ESI-MS分析表明它主要释放带有DP的以内接方式的低聚糖的2-5作为终产物。因此，它可能是一个有效的工具，是产生具有低DP的褐藻胶寡糖的潜在工具。

关键词: 新型褐藻胶裂解酶 pH稳定性 低聚糖

Study on Recombinant Expression and Mode of Action of Novel Alginate Lyase

Abstract

Marine polysaccharide-degrading enzymes play an important role in marine algae degradation and carbon cycling, especially the alginate lyases. Although many alginate lyases have been characterized, theenzymes with industrial potential are still rather rare. A gene, encoding a new alginate lyase AlgNJ04,has been cloned from the marine bacterium Vibrio sp.NJ04.The recombinant alginate lyase was characteried followed by purification on Ni-NTA Sepharose. It exhibited an optimum activity(2414 U/mg) at pH7.0 and 40℃。Notably, the AlgNJ04 retained more than 80% of its maximum activity at a broad pH range of pH7.0 and 10.0,which exhibited excellent pH stability. Additionally,it possessed broader substrate specificity,showing activities towards both poly β-D-mannuronate（polyM）and poly α-L-guluronate(polyG). Furthermore,the Km values of AlgNJ04 towards sodium alginate(0.49mM) and polyG(0.24mM) were lower than that towards polyM(0.86mM). Notably, the activity of AlgNJ04 could be activated by NaCl with certain concentrations, which was partly caused by the removal of bound water from sodium alginate molecules or by the effects of charges in forming the alginate-enzyme complex. The ESI-MS analysis suggested that it mainly released oligosaccharides with DP of 2-5 as end products in an endolytic manner. Therefore,it may be a potent tool to produce alginate oligosaccharides with lower DPs.

Keywords :Alginate lyase; pH stability; Oligosaccharides

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 新型褐藻胶裂解酶简介 1

1.1.1 新型褐藻胶裂解酶概述 1

1.1.2新型褐藻胶裂解酶的研究进展 2

1.1.3 新型褐藻胶裂解酶的来源及分类 2

1.2新型褐藻胶裂解酶的结构组成 2

1.3 新型褐藻胶裂解酶作用模式的研究 3

1.4本课题的研究内容及意义 3

第二章 实验材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.2. 基因克隆和序列分析 5

2.3. AlgNJ-04的表达与纯化 6

2.4. 底物特异性和酶动力学 6

2.5. AlgNJ-04的生化表征 7

2.6.降解产物分析 7

第三章 结果与讨论 8

3.1. 基因AlgNJ-04的序列分析 8

3.2. AlgNJ-04的表达与纯化 11

3.3. AlgNJ-04的生化表征 12

3.4. 降解产物的ESI-MS分析 17

参考文献 18

致谢 23

第一章 绪论

1.1 新型褐藻胶裂解酶简介

1.1.1 新型褐藻胶裂解酶概述

作为海洋碳汇的重要组成部分，褐藻胶可以说是海洋中的一种十分丰富的褐藻类多糖藻类[1]。新型褐藻胶裂解酶是由两种不同结构的α跟β糖醛酸酯组成，具有这种稳定性、高粘度性和凝胶形成性，现在已被广泛应用用作食品工业的添加剂[3-6]。

褐藻胶裂解酶家族（PL家族）的成员新型褐藻胶裂解酶可降解通过消除海新型褐藻胶并在其中产生具有双键的不饱和低聚糖非减量结束[7]。许多褐藻酸裂解酶的基因已被鉴定并可以克隆，从各种来源纯化和表征，如海洋中的一些藻类细菌等[8-10]。根据不同褐藻胶裂解酶的底物特异性来分类可以分为polyG嵌段和polyM嵌段[11]，但是有一些多功能性的酶对这两个嵌段都具有很高的生物活性，这也更加有利于新型褐藻胶的裂解[12-14]。另外，新型褐藻胶裂解酶是组织成七个多糖裂解酶（PL）家族，即PL家族5,6,7,14,15，17和18（http://www.cazy.org/fam/acc_PL.html）的重要组成部分[15]。

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