论文总字数：18228字

摘 要

丙酸作为工业上有着广泛应用的物质，常采用粗甘油做为碳源来发酵生产。但常规生产中，粗甘油的利用率很低，使生产成本增加，也对环境造成不可避免的危害。为了满足工业上用粗甘油生产丙酸的需求，提高粗甘油的利用率，减轻有害物质对丙酸杆菌的阻碍作用，同时响应绿色发展的号召，本文选用产丙酸丙酸杆菌CGMCC 1.2232探索了连续培养丙酸杆菌，研究丙酸杆菌生长特性，分析碳源、氮源对丙酸杆菌生长的影响，用粗甘油驯化菌株，计算菌株生产丙酸的含量。实验结果表明：摇瓶连续培养丙酸杆菌，在适宜环境下，丙酸杆菌生长周期长，OD值偏低；甘油比葡糖糖和乳酸钠更有利于丙酸杆菌的生长；与无机氮相比，添加有机氮源更加适合被丙酸杆菌利用发酵产生丙酸；用粗甘油作为碳源、酵母提取物和蛋白胨作为氮源驯化培养菌株时，对菌株发酵生产丙酸的促进效果最为显著。

关键词：产丙酸丙酸杆菌；粗甘油；驯化；丙酸

Study on the Continuous culture of domesticated Propionibacterium and Production of propionic acid with crude glycerol

ABSTRACT

Propionic acid as food, medicine, chemical and other aspects of a wide range of substances, in the industry often use crude glycerol as a carbon source to ferment production. However, in the conventional production, the utilization of crude glycerol is of a low level, so that production costs increase, but also cause the inevitable harm to the environment. In order to meet the industrial demand for the production of propionic acid with crude glycerol, improve the utilization of crude glycerol, reduce the harmful substances on the inhibition of Propionibacterium, while responding to the call of the green development. In this paper, Propionibacterium CGMCC 1.2232 was used to explore the continuous culture of Propionibacterium（there are two methods for continuous passage of shake flask and constant culture of reactor）, to study the growth characteristics of Propionibacterium and the effects of carbon source and nitrogen source on the growth of Propionibacterium, and the content of propionic acid calculated by crude glycerol. The experimental results show that, with Continuous cultivation of Propionibacteriumin the appropriate environment, Propionibacterium growth cycle is too long, the OD value is of a low level; Glycerol is superior to glucose and sodium lactate for the growth of Propionibacterium; Organic nitrogen source is more suitable for the production of propionic acid than propionic acid; Domesticating the Propionibacterium by crude glycerol, and using the Yeast and peptone as Nitrogen source, it is clear that the Propionibacterium products propionic acid in a positive condition.

KEY WORDS：Propionibacterium、Crude glycerin、Domestication、Propionic acid

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2 生产菌株的生理特性以及营养特性 1

1.2.1 生理特性 1

1.2.2 营养特性 2

1.3微生物发酵法 2

1.3.1微生物发酵法的发展 2

1.3.2 丙酸发酵机理 2

1.3.3微生物发酵法面临的问题 3

1.4连续培养的方法 4

1.5 粗甘油的来源及应用 4

1.6 实验目的 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 材料与仪器 6

2.1.1 实验材料 6

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 实验仪器 6

2.2实验配制 7

2.2.1 培养基的配制 7

2.2.2 试剂的配制 8

2.3 实验步骤 8

2.3.1 菌种活化 8

2.3.2 菌种鉴定 8

2.3.3 生长曲线的测定 9

2.3.4 粗甘油驯化丙酸杆菌 9

2.3.4.1种子培养 9

2.3.4.2连续传代培养 10

2.3.5氮源对菌株生长的影响 10

2.3.6 发酵产物检测 10

2.3.6.1 丙酸标准品的配制 10

2.3.6.2 样品处理 10

2.3.6.3 气相检测条件 11

第三章 实验结果及分析 12

3.1 碳源对菌株生长的影响 12

3.2 菌种形态学分析 15

3.3 丙酸特性研究 15

3.3.1 丙酸标曲的绘制 15

3.3.2 丙酸出峰时间的确定 16

3.4 氮源对菌株生长的影响 17

3.5菌株丙酸产量的检测 18

第四章 结论与展望 22

4.1结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1前言

丙酸 (Propionic acid)，又称甲基乙酸，是一种重要的三碳化合物，无色透明，有刺激性气味，容易对其他物质造成腐蚀，熔点—22℃，相对密度0.99，沸点140.7℃，融于水、乙醚和乙醇，是一种活泼的化学物质。丙酸以及丙酸盐类可以用作防腐剂, 安全性比很多的酸类高, 在购买成本上也是更为便宜^[1]，还可抑制多种细菌微生物的产生,对动物来说具有丰富的营养价值，因此，可以用来对饲料进行防腐保鲜。丙酸盐类可以被用来当做添加剂加入到食品中，可以用于甜点、烘焙产品等的贮存^[2]，延长烘焙物的变质腐败时间；丙酸盐用作饲料保存剂时，可以使动物饲料储存更长的时间，例如晒干的草料，青绿草发酵而成的饲料，水稻和麦子等谷物等，防止腐败变质^[3,4]。丙酸对动物基本无害，可以说是价格容易接受，安全而不失使用性能的防腐剂之一，作为食品防腐剂在市场上具有光明的未来。

目前，能够大量的生产丙酸的国家主要有America、the South Africa、Japan、the United Kingdom以及Germany等发达国家，其中，America生产和消费丙酸占据全世界第一，而我国的生产水平还跟不上工业上的需求^[5]。通常生产丙酸的方法除了化学合成法，还有一种就是微生物发酵法。化学合成法是指利用石油、柴油等化学工业产品作为生产的原材料，然后经过温度的控制、压强的变化、利用催化剂作用等合成；而微生物发酵法，是产酸丙酸杆菌在25℃、1个标准大气压下，利用粮食、木材等进行发酵从而得到产物丙酸。目前工业上丙酸的生产方法占主导地位的还是化学合成法^[6]，但是这种方法对环境污染重，付出的本钱也高，操作条件还特别苛刻。随着经济水平的发展，人们对越来越多物质的开采和滥用，造成世界范围内的环境污染和能源短缺，致使人类越来越青睐绿色健康的生物来源的化学品，而且化石燃料的价格不断上涨，吸引了更多的人去开发和研究用这种绿色发展的方式生产丙酸^[7]。

1.2 生产菌株的生理特性以及营养特性

1.2.1 生理特性

丙酸的生产菌株大多属于丙酸杆菌属^[8]。丙酸杆菌属于革兰氏阳性菌，一般为静止状态，不产生孢子，喜欢温暖的环境，在无恙的环境生存的更好，呈短杆状。丙酸杆菌在条件为 30℃、pH 6.8、120 rpm左右，充氮气保证无氧少氧的环境中生长得最为旺盛 ^[9]。当生长环境的酸碱度在4.5以下时，由于酸度过高，使丙酸杆菌的生长受到阻碍，细胞活性很大程度的衰减^[10,11,12]。

1.2.2 营养特性

丙酸的生长过程中需要各种能量，碳源是其中必不可少的一种重要能源，碳源的多少会决定最终产物丙酸的产量以及在生长过程中丙酸杆菌的生长情况。很多种有机物、无机物都能被丙酸杆菌当成碳源来利用发酵，这些物质一般都是含碳量较高的物质，例如，甘油^[13]、乳糖、葡萄糖^[14]、麦芽糖、蔗糖^[15]、木糖、果糖、乳酸等含碳量较大的物质，都能够被当成碳源，被丙酸杆菌利用来发酵生产丙酸。丙酸杆菌利用前面几种物质做为碳源发酵时，得到的最终产物主要是丙酸，在生产丙酸的同时，也会有很多其他的有机酸副产物生成^[7]。是选择什么氮源、用多少量也对丙酸杆菌的生长、丙酸的合成也有着不可忽视的影响^[16]。

1.3微生物发酵法

1.3.1微生物发酵法的发展

微生物发酵法通常会利用含碳含氮量高的物质来生产丙酸，这些含氮含碳物质大多可以是可再生资源，符合绿色发展的时代前提，生产操作条件也没有化学合成法那么苛刻，这些都是化学合成法所不具备的优势，所以在未来微生物发酵法将占据主导地位。使用微生物发酵发生丙酸面临的问题和难点众多，对这些重点难点进行分析不难发现，如果生产过程中只使用发酵法来生产丙酸，这个过程将会非常艰巨。从正常情况来看，工业上选择通过连续发酵^[17]、藕联发酵^[18]、固定化发酵^[19]等措施去减弱产物酸类物质的反馈抑制作用，增加丙酸的发酵效率，但目前对这些措施的研究和发展一直没有得到明显的成果，还有亟待未来技术上的飞跃。丙酸杆菌发家产生的丙酸，在提取过程中，面临着生产效率和生产本钱之间的矛盾。要实现高生产效率，必须对提取的过程更加精进，这样就一定会使成本高于市场价格，延缓这一方法的发展。

1.3.2 丙酸发酵机理

丙酸杆菌生成丙酸以及其他有机酸混合物的途径通常是：经 EMP 途径，再经过伍德.威克曼循环途径、柠檬酸循环（TCA）途径、糖异生途径等途径，其中包括琥珀酸、异柠檬酸、二氧化碳等产物^[20]。例如，以C₆H₁₂O₆为碳源时发酵生产丙酸的伍德.威克曼循环代谢途径如图1.3.2^[21]:

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