论文总字数：22369字

摘 要

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)由L-谷 氨酸、D-谷氨 酸通过γ-酰 胺键聚合而成，由于其结 构特性而具备多种优点，如高水 溶性、可食用性、可生 物降 解性等等，在化 妆品、环 境保护、医药、食 品、农业等多个领 域均有良好的发展前景。

本课题从菊芋土样中分 离得 到一株新型产γ-PGA的谷 氨酸非依 赖型菌 株，结 合生 理生 化特 征、16S rDN A序 列同 源性分析等方法对该菌进 行初 步分 类鉴 定，确 定该菌为解淀 粉芽 胞杆 菌，命 名为Bacillus amyloliquefaciens NX-2S。

通过紫外扫描光谱分析、核 磁共振法及高效液相色谱法等方法对发酵水解产物的成分、结构进行鉴定分析，结果表明发酵产物为L/D-谷氨酸单体以γ-酰胺键结合而成的高分子聚合物——γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，γ-PGA分子量大小在200-500 k Da。

利用单因素试验对菌株B.amyloliquefaciens NX-2S发酵生产γ-PGA的培养基及培养条件进行了优化，确定了最佳的发酵培养基组成:菊粉粗提液（60 g/L），(NH₄)₂SO₄（6 g/L），K₂HPO₄·3H₂O(20 g/L)，KH₂PO₄(2 g/L)，MgSO₄(0.3 g/L)，MnSO₄·H₂O(0.02 g/L)。确 定了较优的培 养条 件:培 养温 度32 ℃，初 始pH 8.0，装液量80 mL/500 mL摇瓶，接种量2%（V/V），转速200 rpm，发酵时间36 h。最终在7.5 L发酵罐中，γ-PGA产量由原来的3.54 g/L提高到8.6 g/L，发酵时间由48 h缩短到36 h，在一定程度上提高了γ-PGA的生产效率。

本课题组首次利用菊芋中的菊粉为碳源，进行了同步糖化发酵生产聚谷氨酸的研究，其最大优势在于培养基中无需添加谷氨酸及任何氨基酸前体，很大程度地减少了γ-PGA的生产成本。另一方面，菊芋作为一种较为廉价的非粮原料，是工业生产中替代粮食类淀粉质原料的理想选择。此外，在国内目前能利用菊粉发酵生产γ-PGA的菌株还未见报道，这为解析γ-PGA的合成机理又提供了一个参考方向。

关键词：γ-聚谷氨酸 谷氨酸非依赖菌株 菊粉 Bacillus amyloliquefaciens NX-2S

The screening and fermentation optimization of a glutamic acid-independent γ-PGA producing stain

Abstract

γ-PGA is a water soluble poly amino acids which are consisted of D- and L-glutamic acids through γ-glutamy l bonds. It is water soluble, completely biodegradable, non-toxic and edible to human and the environment. γ-PGA has huge potential applications in a wide range of fields such as cosmetics, food, environmental protection, medicine and agriculture.

A new strain NX-2S which was a glutamate-independent producer was selected from the soil of Jerusalem artichoke. With the phenotypic information, the physiology biochemistry experiments, and 16S rDNA gene sequence homologous analysis, the results indicated the strain belongs to genus Bacillus and nominated as Bacillus amyloliquefaciens NX-2S.

The products of the strain Bacillus amyloliquefaciens NX-2S had an absorption peak at 208 nm which was in accordant with the standard γ-PGA. In addition, the products were detected by the nuclear magnetic resonance, the thin layer chromatography (TLC), and high performance liquid chromatography method, respectively. Results showed that the products were composed by L-isomer and D-isomer. The molecular weight was between 200-500 k Da.

The culture medium and the fermentation conditions of the strain NX-2S producing γ-PGA were optimized by single-factor experiment. The optimum culture conditions were as follows: raw inulin extract(60 g/L), (NH₄)₂SO₄（6 g/L）, K₂HPO₄·3H₂O(20 g/L) , KH₂PO₄(2 g/L) , MgSO₄(0.3 g/L) , MnSO₄·H₂O(0.02 g/L), initial pH 8.0, temperature 32 ℃, broth’s volume in shake flask 80 mL/500 mL, rotation speed of rocking bed 200 rpm, inoculation amount 2%(V/V) and culture time 36 h. Under the optimum condition, fermentation time was shortened from 48 h to 36 h, and the yield of γ-PGA was increased from 3.54 g/L to 8.6 g/L.

Compared with the general glutamate dependent strain, Bacillus amyloliquefaciens NX-2S has a great advantage that it can produce γ-PGA without addition of glutamate or any glutamate precursor in the culture medium, which will greatly reduce the cost of production of γ-PGA and lay a good foundation for the industrialized production of the product. On the other hand, the optimum carbon source of the strain is inulin. The research on γ-PGA producing stain using inulin hasn’t been reported in domestic, which promises a novel strategy for the biosynthesis and regulation of γ-PGA.

KEYWORDS: poly-γ-glutamic acid; glutamate independent strain; inulin; Bacillus amyloliquefaciens NX-2S

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 γ-PGA研究背景 1

1.2 γ-PGA的研究进展 1

1.2.1 γ-PGA的结构与性质 1

1.2.2 γ-PGA的应用 1

1.2.3 γ-PGA的产生菌株 2

1.2.4 γ-PGA发酵工艺的研究 2

1.3 研究内容 3

第二章 菌株筛选与产物鉴定 4

2.1 前言 4

2.2 材料与方法 4

2.2.1 材料 4

2.2.2 方法 5

2.3 结果与分析 7

2.3.1 菌株筛选结果 8

2.3.2 菌株鉴定结果 9

2.3.3 产物鉴定结果 11

2.4 本章小结 16

第三章 菌株合成γ-PGA发酵条件优化 17

3.1 引言 17

3.2 材料与方法 17

3.2.1 材料 17

3.2.2 方法 17

3.3 结果与分析 19

3.3.1 单因素优化结果 19

3.3.2 发酵进程曲线 26

3.4 本章小结 26

第四章 结论与展望 27

4.1 结论 27

4.2 展望 27

参考文献 28

致 谢 30

第一章 文献综述

1.1 γ-PGA研究背景

当 今，我们面 临 许 多严 重的问 题，如环境污染、能源紧缺等。为了社会的可持续发展，利用生 物可降 解材料来部分代替污染制品已成为人们的关注点。生 物可降解材料来源很广泛，利于保护环境，同时还能缓解能源危机。作为一种可降解无毒副作用的新型材料——γ-聚谷氨酸（γ-PGA）在未来化 妆品、食品、医药、农业等行业上均会有很大的发展前景。

1.2 γ-PGA的研究进展

1.2.1 γ-PGA的结构与性质

γ-多聚谷氨酸（γ-PGA）是一种高 分子聚 合 物，由L-谷 氨酸与D-谷 氨酸单体聚合而成，通过γ羧 基和α氨 基形 成的肽 键相连，它的分子式如下图所示:

γ-PGA的基 本 骨 架是由γ 羧基和α氨 基 形成的γ-酰 胺 键连接成的直 链分子组成。链间存在着大 量的氢 键，因此水 溶性非常好；另外，γ-PGA的主 链上有着大 量游离的羧 基，使 得γ-PGA有较 强的吸 水保 湿性，能在食 品、化 妆品、农 业、 医 药等^[1]多个领域有着广泛的应用。

1.2.2 γ-PGA的应用

由于γ-PGA具有多种优良性质，已在多个领域有了广泛的应用，如食品、医药、农业、化妆品等行业，并且γ-PGA的运用领域还在不断地挖掘当中^[2]。

1.2.2.1 γ-PGA在食品行业的应用

γ-PGA有类似于胶体的性质，可以提高溶液粘度，可作为食品稳定剂和增稠剂使用。利用γ-PGA的保湿性，在含有面粉的食品如蛋糕、面包等中添加γ-PGA可延长老化时间、改善组织结构和保持形状^[3]。

1.2.2.2 γ-PGA在农业领域的应用

γ-PGA具有特别优良的吸水性，可用来研制吸水剂。通过将γ-PGA经电子束轰击或交联制成树脂，这种树脂可吸收自身重量数百倍的水分，因此可用于包埋植物种子，使在植物不能生长的缺水地区和沙漠，种子也能顺利发芽。另外，γ-PGA也 可作 为农 药的 缓慢 释放 载 体，适量的γ-PGA与杀虫剂等结合可以延长农药中有效成分的作用时间，这对于改善土壤的结构，降低和消除农药的负面影响都具有非常重要的意义^[4]。

1.2.2.3 γ-PGA在化妆品领域中的应用

γ-聚谷氨酸水 凝 胶为无 色、无 味 且透 明的胶 状体，大量的γ-酰 胺 键 连接成的直链分子相互环绕形成三 维 空 间 网 状结构，网孔中可吸附大量水分，因而确 保了γ-PGA的高吸 水保 湿性能，满足了化 妆 品的 保 湿 需 求。

1.2.2.4 其它领域

γ-PGA还可加入宠物、家禽的饲料里，可促 进动 物对磷 元 素的 利 用 效 率，促进新陈代谢。γ-PGA吸水性能好，对皮肤无毒害，可以应用在婴儿尿布中，其吸水能力比传统的聚丙烯酸类尿布高2~5倍。将γ-PGA盐与环氧化物反应制备的聚酯类纤维膜，强度高且弹性好，可以应用在各类针织物。

1.2.3 γ-PGA的产生菌株

根据培养基中是否添加谷氨酸，可把菌株分成两种:一种是添加谷氨酸才能生产γ-PGA的菌株，称为谷氨酸依赖型产γ-PGA菌株。如B.anthracis、B.licheniformis ATCC 9945a等。另一种是不添加或少添加谷氨酸，就可以产生γ-PGA，称为谷氨酸非依赖型产γ-PGA菌株。如B.subtilis 5E、B.subtilis TAM-4等^[5]。

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