论文总字数：17581字

摘 要

农业生产中，磷肥的过度使用会使周边环境中的磷化合物容量升高，导致环境的污染以及农产品中农残的过量。利用生物技术操控解磷微生物的解磷机制，有助于提高磷肥利用率，有利于增加农作物的产量，减轻磷元素的流失对周围环境的危害，有利于开发农业并使其可持续性的发展。本研究的实验目的是寻找高效的解磷菌以及鉴定解磷菌体内关键性酶的活性，如此对酶的解磷机理和实际运用具有重要作用。本研究从农田中分离纯化具有解磷效果的功能菌，实验室编号PD1601。通过微生物发酵实验发现PD1601在酸性条件且碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的环境下均可以进行发酵；利用16S rDNA 技术以及Biolog鉴定手段，辅以生理生化实验（甲基红实验、V.P.实验、柠檬酸盐实验、吲哚实验以及脲酶实验），建立该功能菌的系统发育树，初步判定PD1601为克雷伯氏产酸菌属。通过菌体细胞破碎实验可知，解磷菌PD1601生产胞内酶。

关键词：解磷菌 菌属鉴定 胞内酶

A Preliminary Study on The Population of PD1601 and Identification of Key Enzymes

Abstract

In agricultural production, excessive use of fertilizer will increase amount of phosphorus compounds in the surrounding environment, leading to excessive pollution of the environment, as well as agricultural products agri residual. Using technology to control the phosphorus solubilizing microorganisms mechanism helps to improve utilization of phosphate fertilizer is beneficial to increasing crop yields, reducing phosphorus loss of harm to the environment, conducive to the development and sustainability of the agricultural development. The objective of this study is to find efficient solubilizing bacteria and key enzyme activity in vivo identification of phosphorus bacteria, enzyme mechanism and the practical application of solutions play an important role. This study from the farm in the separation and purification of functional bacteria with solubilizing effect, laboratory number, PD1601. Through microbial fermentation experiment found PD1601 in acid conditions and carbon source for glucose, and maltose, and sucrose of environment Xia are can for fermentation; using 16S rDNA technology and Biolog identification means, auxiliary to physiological biochemical experiment (methyl red experiment, and V.P. experiment, and lemon acid salt experiment, and h indole experiment and urea enzyme experiment), established the function bacteria of system development tree, preliminary judge PD1601 for Crabb's produced acid bacteria is.By bacteria breaking experiments showed that phosphorus PD1601 the production of intracellular enzymes.

Key words: phosphate-solubilizing bacteria；identification of bacteria；entoenzyme

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1背景介绍 1

1.2国内外研究进展 2

1.3研究方法及途径 4

1.4研究目的及意义 4

第二章 菌属鉴定 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 实验试剂 5

2.1.2 实验仪器 5

2.2 生理生化实验 6

2.2.1 糖发酵实验 6

2.2.2 甲基红(Methylred)试验(MR试验) 9

2.2.3 吲哚（靛基质）试验 10

2.2.4 柠檬酸盐利用试验 10

2.2.5 Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P.试验） 11

2.2.6 脲酶实验 11

2.3 微生物系统Biolog鉴定 13

2.3.1 鉴定步骤 13

2.3.2 软件使用 13

2.4 分子生物学16S rRNA鉴定 14

2.4.1 PCR扩增 14

2.4.2 制胶 15

2.4.3 电泳跑胶 15

2.4.4 鉴定结果 16

2.4.5 建立系统发育树 17

第三章 关键性酶的初步研究 18

3.1 细菌产酶相关鉴定 18

3.1.1 实验项目 18

3.1.2 所需试剂 18

3.1.3 试验方法 18

3.1.4 实验结果 19

3.1.5 分析与讨论 21

第四章 总结 22

参考文献 23

致谢 26

第一章 文献综述

1.1背景介绍

磷是生物中重要的营养元素。磷也是构成原始矿物质的重要部分，磷是承载能量的重要元素。与动植物相关的生理活动氧化产能作用包括光合作用都需要有磷元素的介入。空气中没有现成的含有磷元素的化合物，所以它的循环来源很单调，不像其他碳氮元素的循环模式很完善。磷元素大体在泥土或水体中循环，还有在生物包括植物和微生物中传递。泥土里有许多磷化合物矿物质，可分为有机磷和无机磷，有机磷占磷化合物的百分之五十至百分之六十。泥土中的无机磷大致分为原先生成的矿物质和衍生矿物质，衍生的矿物质以沉淀形态的磷酸矿物盐组成，而原生矿物质则以磷灰石为主要成分。衍生的矿物质分为容易供磷的形态和供磷能力活性弱的形态，供磷能力强的被称为开蓄状态能直接为植物所吸收利用。根据近年来文献所述，我国大概有百分之七十五的土地中土壤缺磷。泥土中百分之九十五的磷元素又以无作用的形态生存，植物难以直接利用的零元素占大多数。土壤中平均含磷量约0.12%，并且磷元素在土壤溶液中的含量仅为0.005 mg/kg 至 1.0 mg/kg 。每个季度中植物磷肥利用效率也仅为百分之五至百分之十，于是显然大部分磷会作为无效态在土壤中积累。由于长期施用含磷化肥，目前土壤中磷元素丰富以及磷元素流失不足，是耕地土壤的最大问题。泥土中有大量的解磷微细菌微生物例如芽孢杆细菌、欧文氏细菌、埃希氏细菌、硫杆细菌、土壤杆细菌，沙雷氏细菌，还有真菌如曲霉真菌、有链霉真菌、菌根真菌、根霉真菌、青霉真菌、放线真菌等，这些细菌和真菌具有分解降解磷化合物，使磷在泥土中循环的作用，它们还可以将溶解能力差的磷转变为溶解能力强的磷化合物，它们对磷元素的影响是最重要的。解磷菌有两种类别，可以消融有机磷的有机磷解磷细菌和消融无机磷的解磷细菌，是根据解磷菌分解底物的不同，而现实上却很难辨别他们 ^[7]。

虽然土壤中有许多磷元素，无论以有机磷还是无机磷的形式，但是由于磷元素可利用率很低，所以它仍然是限制植物生长的主要营养元素。土壤中普遍存在解磷微生物，它们可以通过环保和可持续的方法，为植物生长提供更多的有效磷^[13]。

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