论文总字数：18518字

摘 要

从巨大芽孢杆菌DSM319中克隆β-淀粉酶基因，以大肠杆菌构建重组菌株，通过快速发酵得到高活性的β-淀粉酶。旨在通过优化发酵产酶条件来提高β-淀粉酶的产量与活力，以便探索其酶学性质，获得最佳催化条件。在进行诱导表达的同时，添加并考察金属离子等无机物对蛋白表达的作用效果。由正交实验的结果，温度对发酵产酶的影响作用最大，其次是时间和诱导剂浓度。然后经酶活反应，测定分析得到出β-淀粉酶最佳反应温度为40℃，pH为6.0，且其在温度范围45～60℃、pH范围4～9内比较稳定；阿拉伯糖对酶活力提高有促进作用；纯化后的蛋白酶液，酶活力值和蛋白质浓度分别是纯化前的1.8和1.4倍。

关键词：β-淀粉酶 发酵优化 酶活力值 分离纯化 酶学性质

Heterologously expression of beta amylase gene from recombinant e.coli, exploring its fermentation optimization and enzymology properties

ABSTRAC

Clone beta amylase gene from Bacillus megatherium DSM319, for construct recombinant in bacillus coli, and acquire highly active beta amylase through quick fermentation. Aimed at optimizing the fermentation conditions of enzyme production, to improve enzyme activity, and explore its enzymatic properties, so as to obtain the beta amylase optimum catalytic condition. While inducing expression, add then study the effect degree of metal irons or other inorganic matter that function on protein expression. Through orthogonal test, make the conclusion that the induction temperature has the largest influence on fermentation of beta amylase, followed by the induction time and IPTG concentration. After by the enzyme reaction, measurement analysis for beta amylase optimum reaction are, temperature of 40℃，pH6.0, and that is relatively stable within temperature range from 45 to 60℃，pH range from 4.0 to 9.0. Plus, the arabinose stimulates the enzyme activity. In addition, after nickel column affinity chromatography separation and purification, enzyme activity for crude enzyme increased almost 1.8 times, and protein concentration 1.4 times than before.

Key words: beta amylase; fermentation optimization; enzyme activity; separation; purification; enzymatic property

目 录

摘要 I

ABSTRAC II

第一章 文献综述 1

1.1 选题背景 1

1.2 β-淀粉酶 1

1.2.1 β-淀粉酶概述 1

1.2.3 β-淀粉酶性质 1

1.2.4 β-淀粉酶的作用形式 1

1.2.5 β-淀粉酶鉴定方法 2

1.2.6 β-淀粉酶使用价值 2

1.3 不同来源β-淀粉酶性质比较 2

1.4 酶活力影响因素 3

1.5 本课题研究目的及意义 4

第二章 发酵优化与酶学性质研究 5

2.1 实验材料 6

2.1.1菌种 6

2.1.2实验试剂 6

2.1.3实验仪器 7

2.1.4主要溶液与培养基 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 重组菌株培养与诱导表达 9

2.2.2 单因素优化发酵产β-淀粉酶 9

2.2.3正交实验优化 10

2.2.4不同添加物对蛋白表达的影响 10

2.2.5粗酶液提取 10

2.2.6 β-淀粉酶分离纯化 11

2.2.7最适温度测定 11

2.2.8最适pH测定 11

2.2.9热稳定性测定 11

2.2.10温度稳定性和pH稳定性测定 11

2.3 分析方法 12

2.3.1 SDS蛋白凝胶电泳分析 12

2.3.2麦芽糖标准曲线绘制 13

2.3.3 β-淀粉酶酶活反应与测定方法建立 13

2.3.4蛋白浓度测定 13

第三章 结果分析 15

3.1 麦芽糖标准曲线绘制 15

3.2 蛋白质标准曲线绘制 15

3.3 单因素诱导 16

3.3.1诱导剂浓度影响发酵产酶 16

3.3.2诱导时间影响发酵产酶 16

3.3.3诱导温度影响发酵产酶 16

3.4 正交试验 17

3.5 不同添加物对可溶性蛋白表达的影响 18

3.6 β-淀粉酶分离纯化 19

3.7 SDS-PAGE分析 19

3.8 最适温度和最适pH 20

3.9 热稳定性 21

3.10 温度稳定性和pH稳定性 22

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

致谢 26

第一章 文献综述

• 1. 选题背景

目前，生产需要及科学实验所需要的β-淀粉酶主要从高等植物中提取而来，其中来源最广泛的当属谷物类，比如小麦、大麦、大豆等。因为β-淀粉酶无法从动物体获取，所以目前工业上使用的β-淀粉酶除了来源于植物体之外，另一个途径就是微生物体内。二者相比之下，微生物来源的β-淀粉酶生产成本更低，目前正受到社会研究的广泛关注，已经发现了部分微生物菌种，如巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等，可供提取β-淀粉酶，且用来制备的麦芽糖含量可以高达60%以上。但是，从此类菌株提取的β-淀粉酶耐热性并不理想。因此，筛选出能够高产且活力较高的β-淀粉酶微生物菌种，成为目前β-淀粉酶研究的一条主要思路。

本课题拟探究在大肠杆菌模式微生物体内构建高效表达β-淀粉酶的合成途径，构建重组菌株E.coli BL21（pET-BA）的β-淀粉酶基因从巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）中克隆得到，通过优化发酵条件，得到β-淀粉酶，以淀粉水解液为原料制备高纯麦芽糖，并对重组β-淀粉酶的酶学性质进行探究^[1-2]。

• 1. β-淀粉酶

1.2.1 β-淀粉酶概述

请支付后下载全文，论文总字数：18518字