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摘 要

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是赖氨酸单体通过聚赖氨酸合成酶（Pls）组装而成的，通过Pls序列分析发现Pls是一种特殊的非核糖体合成酶，由腺苷酸化结构域、氨基酸载体蛋白结构域和一个奇特的缩合结构域构成，但是三者如何共同作用组装赖氨酸单体最终形成ε-PL尚不清晰。为了比较方便的对Pls结构域功能进行研究，我们尝试将Pls在链霉菌底盘微生物中进行表达。由于遗传背景清晰、遗传转化体系比较成熟，Streptomyces lividans TK24被作为一种链霉菌的底盘生物而进行各种链霉菌基因的异源表达工作。在本实验中，我们将本实验室的Streptomyces albulus PD-1中pls基因导入到链霉菌底盘微生物S. lividans TK24中进行异源表达，来验证Pls异源表达的可行性，为Pls的催化机制研究奠定基础。

关键词：ε-聚赖氨酸 链霉菌 ε-聚赖氨酸合成酶 异源表达

Study on Heterologous expression of ε-poly-L-lysine synthetase in Streptomyces lividans TK24

Abstract

ε-Poly-L-lysine (ε-PL) is assembled by Lysine monomer by ε-PL synthetase (Pls). Pls is a special kind of the non-ribosomal peptide synthetases, consisted of an adenylation domain, thiolation domain and a novel Condensation domain. The mechanism of Pls assembling lysine monomer to form epsilon ε-PL is unclear. Due to the clear genetic background and efficient genetic transformation system, Streptomyces lividans Tk24 is one of the classical Streptomyces strain used in the study of the genes of Streptomyces strain. In order to study the function of Pls, we attempt to express Pls in S. lividans TK24. This study will pave the road for the study of the Pls.

Key Words：ε-Poly-L-lysine；Streptomyces；ε-Poly-L-lysine synthetase；Heterologous expression

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 聚赖氨酸 2

1.1.1 ε-PL的结构及理化性质 2

1.1.2 聚赖氨酸的生产方法 2

1.1.3 ε-PL的应用 3

1.1.4 ε-PL的生物合成与降解机制 5

第二章 实验材料与方法 8

2.1 实验仪器及试剂 8

2.2 菌株与质粒 9

2.3 培养基 9

2.4 聚-L-二氨基丙酸前体合成关键酶基因的引物设计 9

2.5 Pls关键酶基因的克隆 10

2.5.1 基因组DNA的提取 10

2.5.2 常规PCR反应体系及反应条件 10

2.5.3 PCR产物纯化 11

2.5.4 DNA与克隆载体的连接和转化 11

2.5.5 阳性克隆的挑选与测序 11

2.6 Pls基因的外源表达 11

2.6.1 pls基因表达载体的构建 11

2.6.2 pls在S. lividans TK24的异源表达 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 pls在S .lividans TK24中的表达 12

3.1.1 S. albulus PD-1中pls相关序列的获取 12

3.1.2 pIB139-pls质粒的构建 12

3.1.3 pls基因在S. lividans TK24中异源表达 14

3.2 pls加上其自身启动子在S. lividans TK24中的表达 14

3.2.1 S. albulus PD-1中pls promoter相关序列的获取 14

3.2.2 pIB139-pls promoter质粒的构建 14

3.2.3 pls promoter在S. lividans TK24中异源表达 16

3.3 总结 17

第四章展望 18

参考文献 19

致谢 20

第一章 文献综述

食品受到微生物污染而腐败变质是造成食品安全问题的重要因素之一。食品的腐败变质不仅会造成了资源上的浪费，还会严重危害消费者的身体健康。据统计，全世界每年因腐败变质而造成的食物损失量高达10%-20%。发展食品工业，首要面对的问题便是：如何全面有效地控制食品的腐败变质。我们经常会需要在食品的加工过程中添加食品防腐剂以延长食品的保藏期和防止食品受到微生物污染。我国目前使用的防腐剂大多数都是化学合成防腐剂，如硝酸盐、双乙酸钠、焦亚硫酸钾（钠）、山梨酸及其钾盐、苯甲酸及其钠盐、丙酸钙（钠）和脱氢醋酸等。科学研究表明，化学防腐剂的超剂量使用会造成一定程度的毒性积累；而且其中一些化学合成防腐剂还具有很强的诱癌致畸性，在使用过程中存在着一定的安全隐患。天然防腐剂是从微生物、动植物的代谢产物或者其它的天然产物中提取的一种物质，该类物质对人体没有毒害作用，能增进食品的风味品质，是替代化学防腐剂的最佳选择。然而从目前来看，天然的食品防腐剂的价格还是普遍的偏高，阻碍了其推广和应用。能否提高天然食品防腐剂的生产效率及降低生产成本，已成为其能否大范围推广应用的重要因素。现在大部分微生物源防腐剂大多是利用生物发酵的方法生产制得，因此可能通过运用现代生物技术手段，对天然食品防腐剂的菌种进行筛选对发酵工艺进行优化改进，以此来有效提高生产效率，降低生产成本。我们相信，随着科技的不断发展以及相关研究的深入我们将能时行工业化地生产天然食品防腐剂，生物防腐剂替代化学防腐剂必将是大势所趋。研究结果表明，微生物源防腐剂不仅对人体的安全无任何的毒害作用，还具有一定的营养价值，大力开发安全无毒、高效、经济的生物防腐剂，已成为食品保鲜的必然发展方向之一。目前世界上各个国家常用的微生物源防腐剂主要包括了纳他霉素（Natamycin）、ε-聚赖氨酸（ε-PL）以及乳酸链球菌素（Nisin）。本论文围绕一种高效的微生物防腐剂ε-PL的合成关键酶在链霉菌的底盘微生物中的表达为主要内容展开。

1.1 聚赖氨酸

ε-PL是日本的酒井平一和岛昭二[1]两位博士1977年在大量筛选有价值的生物碱（Dragendorff-positive）物质时首次发现的一种新型聚合物。ε-PL具有广谱抑菌性，它不仅能够抑制一些革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及病毒的活性，并且还具有安全性能高、水溶性好、热稳定性好等优良特点。所以ε-PL是一种性能十分优良的生物防腐剂。此外，ε-PL在基因载体、化妆品、电子材料、药物包被物和环保材料等领域也具有广阔的应用和开发的前景。目前世界上仅有日本实现了ε-PL工业化[2]，总之，ε-PL作为一种具有巨大的应用潜力与商业价值的生物高分子，已成为众多学者的研究热点。

1.1.1 ε-PL的结构及理化性质

ε-PL是一种通过微生物大量生产的氨基酸同型聚合物。它是由人体必需氨基酸L-赖氨酸的ε-氨基和另一L-赖氨酸的α-羧基形成的一种ε-酰胺键连接而成的[3]，结构式如图3-1所示。

图1-2 ε-PL的结构式

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