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摘 要

目前，异麦芽酮糖的生产主要是通过微生物体内的蔗糖异构酶（EC 5.4.99.11，Sucrose isomerase，SIase）催化蔗糖异构化而进行。Escherichia coli (pET-22b-palⅠ)是本实验室构建的可高效表达蔗糖异构酶的菌株。本研究以壳聚糖和明胶为原料，采用真空冷冻干燥技术制成壳聚糖-明胶海绵，再将重组工程菌E.coli (pET-22b-palⅠ) 通过吸附-交联法固定在壳聚糖-明胶海绵载体上，考察了菌体添加量、交联剂浓度、温度等条件因素对固定化效果的影响；初步研究了该固定化细胞的酶学性质及其动力学参数；并对固定化细胞进行重复分批转化试验，考察其操作稳定性。试验结果表明：以200 mg/g载体的菌体添加量，0.6%的戊二醛浓度，在4 ℃、pH为6.0的条件下固定4 h时，固定化效果最佳，此时固定化细胞的酶活回收率为86.2%；固定化细胞的最适反应温度为30 ℃，最适pH为6.0左右，且对温度和pH的稳定性性质较游离细胞有了一定的改善；得到固定化细胞的K_m=1106.0928 mmol/L和v_max=59.0454.2534 umol/(L*S)；固定化细胞具有较好的操作稳定性，连续转化20批次后蔗糖转化率仍无明显下降，均在90%以上。

关键词：蔗糖异构酶产生菌 固定化细胞 壳聚糖-明胶海绵

Study on the immobilization of Escherichia coli (pET - 22 b - Pal Ⅰ)producing sucrose isomerase with sponge

Abstract

At present, the production of isomaltulose in domestic and foreign is widely used biological catalysis method based on the isomerization of sucrose, sucrose isomerase catalyzes sucrose by microorganisms. Sucrose isomerase (EC 5.4.99.11, SIase) from the recombinant engineering bacteria Escherichia coli (pET-22b-pal I) can catalyze the sucrose isomerization to isomaltose. In this experiment, chitosan and gelatin were used as raw material to made chitosan gelatin sponge by vacuum freeze drying technology, and then the recombinant strains E.coli (pET-22b-pal I) is fixed on the chitosan gelatin sponge carrier by adsorption and cross-linking method , investigated the effection of immobilization conditions on the immobilization effect; studied on enzymatic properties and the kinetic parameters of the immobilized cell; the repeated batch transformation test were done to investigate the operation stability of the immobilized cell. The test results that: when the amount of enzyme is 200 mg/g carrier, the concentration of glutaraldehyde is 0.6%, the temperature is 4 ℃, the pH is 6.0, the time is 4 h，the fixed effect is the best, the recovery rate of enzyme activity was 86.2%; the optimum reaction temperature is 30 ℃, the optimum pH is 6.0, the optimum temperature and pH are higher than the free cells; the K_m and v_max of immobilized cells is626.60 mmol/L and 59.04 umol/ (L*S); immobilized cells for 20 batches, the conversion of sucrose decreased significantly, were more than 90%.

Key words: producing bacteria of sucrose isomerase, immobilized, chitosan gelatin sponge

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1细胞的固定化技术 1

1.1.1细胞的固定化的特点 1

1.1.2细胞的固定化方法 1

（1）吸附法 1

（2）共价结合法 1

（3）交联法 2

（4）包埋法 2

1.1.3细胞固定化的载体 2

1.1.4固定化细胞的评价指标 3

1.1.5固定化细胞的性质 3

1.2异麦芽酮糖 4

1.3蔗糖异构酶 4

第二章 材料与方法 6

2.1材料与设备 6

2.1.1主要试剂 6

2.1.2仪器与设备 7

2.1.3实验菌种 7

2.1.4培养基 7

2.1.5缓冲体系 7

2.2实验方法 8

2.2.1壳聚糖-明胶海绵的制作 8

2.2.2菌体的培养与收集 8

2.2.3细胞的固定化 8

2.2.4异麦芽酮糖标准曲线的测定 8

2.2.5细胞活性的测定 9

2.2.6糖组分的测定 9

2.2.7固定化条件的研究 9

2.2.8固定化细胞的性酶学性质 10

2.2.9固定化细胞的分批转化实验 10

第三章 结果与讨论 12

3.1异麦芽酮糖标准曲线 12

3.2游离细胞的酶活力 12

3.3固定化条件的研究 12

3.3.1菌体添加量对固定化效果的影响 12

3.3.2戊二醛浓度对固定化效果的影响 13

3.3.3固定化时间对固定化效果的影响 14

3.3.4温度对固定化效果的影响 14

3.3.5pH对固定化效果的影响 15

3.4固定化细胞的酶学性质 16

3.4.1最适温度 16

3.4.2最适pH 17

3.5 Km和Vmax 18

3.6固定化细胞的批次转化实验 19

3.6.1固定化细胞蔗糖转化的完全反应时间 19

3.6.2重复批次转化实验 19

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2展望 21

参考文献 23

致谢 25

第一章 文献综述

1.1细胞的固定化技术

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