论文总字数：26681字

摘 要

araBAD操纵子由araB，araA和araD三个代谢基因组成，分别编码L-核酮糖激酶，L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶；这些酶将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，D-木酮糖-5-磷酸为戊糖磷酸途径的一种中间产物。该途径使得微生物能够利用阿拉伯糖作为唯一碳源。细菌利用L-阿拉伯糖分解代谢的第一步是通过L-阿拉伯糖异构酶的催化。

L-阿拉伯糖异构酶可催化L-阿拉伯糖异构化成为L-核酮糖。这种酶极具商业利益，因为它还能再体外催化D-半乳糖的转化塔格糖。

稀有糖是自然界中存在，但含量极为稀少的一类单糖及其相应的衍生物。它们具有广泛的用途，可作为甜味剂、功能性食品和药物等。L-核酮糖是一种重要的稀有糖，可以用作抗病毒药物的前体。它可以通过从L-阿拉伯糖，D-核糖，或D-甘露糖-1,4-内酯化等通过化学方法来制造。然而，与此相比，通过使用L-阿拉伯糖异构酶的生物催化生产L-核酮糖是更加具有工业价值的方法。原料L-阿拉伯糖，是木质纤维材料的常见成分，其成本大约只有每公斤0.10美元。因此，该生物催化剂L-阿拉伯糖异构酶的成本，是生物法工业化生产L-核酮糖的主要的障碍。

尽管L-阿拉伯糖异构酶可从不同的微生物得到，如大肠杆菌，烷嗜热厌氧杆菌 ，那不勒斯栖热袍，海栖热袍菌，土芽孢杆菌属的嗜热脂肪菌和脂环嗜酸热菌等，而且已经被克隆和表征，但L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖的特异性和产率仍不尽如人意。

在我们的工作中，一种来自枯草芽孢杆菌的新型的L-阿拉伯糖异构酶基因，被克隆，并在大肠杆菌中表达。相对于其他的L-阿拉伯糖异构酶，枯草芽孢杆菌L-AI（BSAI）对L-阿拉伯糖转化有着宽泛的反应pH和极高的催化效率。

关键词：生物催化；L-阿拉伯糖异构酶；L-核糖

Abstract

The araBAD operon consists of three metabolic genes, araB, araA and araD, encoding L-ribulokinase, L-arabinose isomerase, and L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase, respectively; these enzymes convert L-arabinose to D-xylulose-5-phosphate, an intermediate in the pentose phosphate pathway . This pathway allows microorganisms to utilize arabinose as a sole carbon source. The first step in the catabolism of L-arabinose by Escherichia coli is catalyzed by the enzyme L-arabinose isomerase.

L-arabinose isomerase can catalyze the isomerization of L-arabinose to L-ribulose in vivo. This enzyme is also of commercial interest as it catalyzes the conversion of D-galactose to Dtagatose in vitro.

Rare sugars are unique monosaccharides or derivatives that rarely occur in nature. They are expected to have a wide range of uses, from sweeteners to functional foods and drugs. L-Ribulose is an important rare sugARthat can be used as a precursor for the synthesis of antiviral drugs. It can be manufactured through chemical procedures from L-arabinose, D-ribose, or D-mannono-1,4-lactone. However, production of L-ribulose by biocatalysis using L-arabinose isomerase can be a valuable industrial process. The starting material is L-arabinose, a common component of lignocellulosic materials, which has a cost estimate of around only $0.10 per kg. Thus, the cost of the biocatalyst, L-AI, is the main obstacle to the industrialization of biological L-ribulose production.

Although L-AIs from different microorganisms, such as Escherichia coli, Thermoanaerobacter mathranii,Thermotoga neapolitana, Thermotoga maritima ,Geobacillus stearothermophilus and Alicyclobacillus acidocaldarius, have been cloned and characterized, the specificity and productivity of conversion of L-arabinose to L-ribulose is still not satisfactory.

In this work, a novel L-AI gene was cloned from bacillus subtilis and expressed in E. coli. Compared to other L-AIs, bacillus subtilis L-AI (BSAI) has a wide pH range and high catalytic efficiency for L-arabinose conversion .

Key words: biocatalyst ;L-arabinose isomerase; L-ribose

目 录

新型L-阿拉伯糖异构酶的筛选 I

和表征研究 I

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 稀有单糖概述 1

1.2.1 L-阿拉伯糖简介 2

1.2.2 L-核糖的生理功能 2

1.2.3 L-核糖的医药应用 3

1.3 L-核糖的制备 4

1.3.1 以核糖醇为原料的生物转化 4

1.3.2 以 L-阿拉伯糖为原料的生物转化 5

1.4 L-阿拉伯糖异构酶的应用与研究 6

1.5 论文意义及内容 7

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与质粒 7

2.1.2实验仪器与试剂 7

2.1.3 培养基及培养条件 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 PCR反应 9

2.2.2 目的片段araA与载体质粒pET28连接、转化 9

2.2.3重组子pET28a-araA的鉴定： 9

2.2.4重组大肠杆菌的诱导表达 10

2.2.5 比色法测L-阿拉伯糖异构酶的活力 10

2.2.6 L-AI重组菌培养及诱导条件优化 10

2.2.7 L-阿拉伯糖异构酶酶学性质的研究 10

2.2.8产物分析方法 11

第三章 结果与讨论 12

3.1编码L-AI的基因araA的鉴定和表征 12

3.2 araA基因的异源表达和L-AI的表征 12

3.3 底物特异性研究 13

3.4 BSAI催化L-阿拉伯糖条件的研究 13

3.4.1温度和pH值对BSAI酶活的影响 13

3.4.2金属离子对BSAI酶活的影响 14

3.4.3 BSAI酶学动力学参数 15

3.5本章小结 16

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 引言

作为一种重要的医药中间体，L-核糖具有极高的医学价值。由L-核糖合成的各种L-核糖衍生物，在抗病毒和抗肿瘤领域被广泛应用。在自然界中不存在L-核糖，所以L-核糖属于极其稀有的单糖，需由其他物质合成或转化获得。其制备方法分为早期的化学合成法和近几年新兴的生物转化法。目前国外研究趋势是通过不同菌种来源寻找活性更高的异构酶制备L-核糖。而国内对稀有糖的研究很少，但是对L-核糖的需求却较大，因此应该加强对L-核糖制备方面的基础探索。

1.2 稀有单糖概述

稀有糖的一个分支稀有单糖，稀有单糖作为功能性甜味剂的新兴领域[1]。2001 年ISRS（即国际稀有糖协会）成立，首次提出了稀有单糖的定义。随着研究的进行，深入延伸到生理功能上，进而发现除了单糖，它们的衍生物也具有相似的功能，因此再次完善稀有单糖的定义，“即在自然界中存在但是含量极为稀少的一类单糖及其相应的衍生物[2]”。

在长期的制糖工业中，稀有单糖逐渐被重视，随着人类生活水平的不断提高，满为了足了人们对甜味口感的追求，各种食品中对糖的添加量不断增加。但与此同时，糖的不断摄入也引发了糖尿病和肥胖等健康问题[3]。

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