论文总字数：19786字

摘 要

γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）又称γ谷氨酰转移酶，普遍存在于生物体内，是生物体内谷胱甘肽代谢中的关键酶之一，它能特异性地催化γ谷氨酰基的转移反应，并参与了氨基酸的跨膜运输^[1]。随着生物技术的发展，GGT在生物催化方面的应用开始备受关注，因此对GGT的研究也逐渐增多。本课题组在前期工作中已构建了高pH稳定性的突变株（D46V-E502V）、（Y280V-E502V）、（D46V-Y280V）的基础上，对突变菌株的发酵、诱导条件进行优化，并建立其分离纯化方法；对纯化后的突变酶的热力学性质进行研究。实验结果表明，突变酶（D46V-Y280V）对受体的亲和力最强；三种的反应活化能较野生型wt_GGT均有不同程度的增加；热稳定性方面，突变酶（D46V-E502V）、（Y280V-E502V）在50℃下处理3小时的残余酶活分别为72.17%、70.27%，比wt_GGT高出一倍。

关键词：γ-谷氨酰转肽酶；突变菌株；发酵；分离纯化；热力学性质

Separation and purification of three mutant GGT and research of their thermodynamic properties

ABSTRACT

γ-glutamyltranspeptidase (GGT，EC 2.3.2.2)，also known as γ-glutamyl- transferase，commonly found in organism，is one of the key enzymes in metabolism of glutathione，it can specifically catalyze the transfer reaction of γ-glutamyl and participate in the transmembrane transport of amino acids ^[1]_．With the development of biotechnology，GGT in biological catalysis began concern，so the study of GGT is also gradually increased．In previous work by our group has built three high pH stability mutant，they are (D46V-E502V)，(Y280V-E502V)，(D46V-Y280V)，based on the fermentation of the mutant strains induced conditions were optimized，and establish its separation and purification methods；on the thermodynamic properties of the purified mutant enzymes were studied．Experimental results show that the mutant enzyme (D46V-Y280V) the strongest affinity for the receptor；activation energy than the wild-type wt_GGT varying degrees of increase of three responses； thermal stability，the mutant enzyme (D46V-E502V)，(Y280V-E502V) for 3 hours at 50 ℃ residual activity was 72.17%，70.27%，higher than the wt_GGT doubled．

Key words: GGT; Mutant strains; Ferment; Isolation and Purification; Thermodynamic propertie

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 γ-谷氨酰转肽酶概述 1

1.2 γ-谷氨酰转肽酶的结构 1

1.3 γ-谷氨酰转肽酶的催化机制及其在生物合成中的应用 2

1.4 γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化方法 3

1.4.1 盐析法 3

1.4.2 离子交换柱层析法 3

1.4.3 疏水层析法 3

1.4.4 电泳法 4

1.4.5 亲和层析法 4

1.5 本课题的研究的目的、意义和主要内容 4

1.5.1 研究的目的和意义 4

1.5.2 研究的主要内容 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验菌株 6

2.1.2 实验仪器与试剂 6

2.1.3 主要溶液的配制 7

2.1.4 分析方法 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 重组野生型GGT最佳诱导发酵条件的研究 9

2.2.2 GGT的分离纯化研究 10

2.2.3 wt_GGT和突变型GGT酶学性质研究 10

第三章 结果与讨论 12

3.1 野生型GGT最佳诱导发酵条件的研究 12

3.1.1 菌体生长量 12

3.1.2 最佳诱导温度的确定 12

3.1.3 乳糖最佳浓度的确定 13

3.1.4 最佳诱导时间的确定 14

3.2 突变酶的诱导表达、纯化及SDS-PAGE验证 14

3.3 wt_GGT和突变型GGT酶学性质研究 15

3.3.1 催化动力学常数的测定 15

3.3.2 突变酶酰基化反应活化能E_a的测定 16

3.3.3 最适反应温度 17

3.3.4 热稳定性 17

3.3.5 热失活速率常数与热失活反应活化能的测定 18

3.3.6 亚基之间稳定性的分析 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 23

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 γ-谷氨酰转肽酶概述

γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）又称γ谷氨酰转移酶，在自然界中分布广泛，普遍存在于动物、植物、微生物体内，是生物体内谷氨酰循环（谷胱甘肽合成途径）中的关键酶^[1-3]。研究表明，GGT在不同的有机体中的分布有所差异，在哺乳类动物中GGT存在于细胞表面，大亚基与细胞膜外表面以共价键结合，小亚基与大亚基以疏水键和离子键等作用力结合；在细菌中GGT存在于细胞的壁膜间隙，或分泌到胞外，且大亚基比在哺乳类动物的略小；而在植物中，GGT主要存在于质外体或液泡中。

1.2 γ-谷氨酰转肽酶的结构

研究表明，不同来源的GGT分子组成相同，均为异源二聚体蛋白，由大、小两个亚基组成。成熟的γ-谷氨酰转肽酶是一种存在于细菌、真菌、植物、哺乳类动物中的异质二聚体酶，包含一个大亚基（～40KDa）和一个小亚基（～20KDa），由一个大小~60KDa的没有催化活性的蛋白前体经转译后自主催化分裂而来。成熟的GGT的N端有一个严格保守的苏氨酸（-Thr），是GGT的催化残基，可亲核攻击供体分子的羰基碳原子。

2006年Toshihiro Okada等首次通过X射线衍射的方法测定了大肠杆菌GGT的3D结构(PDB code：2DG5)，并简要阐述了GGT催化和底物结合结构域的基本特征^[4]。2008年和2010年，Sharath和Wada等先后报道了2条枯草芽孢杆菌GGT的晶体结构（2V36和3A75）（如图1-1）。分析结果显示，B.subtilis GGT催化口袋结构与大肠杆菌GGT类似，但缺乏大肠杆菌和幽门螺杆菌GGT中常见的“盖环”（Lid-loop）结构。因此，B.subtilis GGT与底物形成的复合物结构是完全开放的，底物和反应产物均暴露于溶剂，使其在催化作用时的结构变化比E.coli来源的GGT更灵活。这些结构的差异导致来源于E.coli 的GGT酶活比B.subtilis来源的GGT酶活低了30倍以上。

请支付后下载全文，论文总字数：19786字