论文总字数：21580字

摘 要

γ-谷氨酰转肽酶 （γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）,又叫做γ-谷氨酰转移酶,广泛存在于生物体内,能够特异性催化谷胱甘肽的γ-谷氨酰基断裂，但因为GGT催化的谷氨酰基转移反应要在碱性条件下发生，但是野生型GGT对各种环境的耐受性较差。为了解决这个问题，本课题提取并扩增B.subtilis NX-2的ggt基因，构建pET-22b-Bggt重组表达载体，通过分析野生型GGT大、小亚基作用面上残基的组成、性质及空间位置，选出突变位点，设计突变引物，利用PCR介导对BGGT基因组进行定点突变，合成突变基因，在E．coli表达系统中表达，检验突变酶在不同pH下的催化特性和稳定性，发现稳定性比较好的是组合突变体D46V-E502V、Y280V-E502V、D46V-Y280V三组突变体，其中突变体D46V-Y280V突变体对受体的亲和力最强；在pH稳定性方面，pH11.0的高碱性环境下处理3h后，突变酶D46V-E502V、Y280V-E502V的残余酶活仍然达到了40%左右，比野生型GGT残余酶活20%高出一倍。

关键词：γ-谷氨酰转肽酶 PCR 定点突变 PH稳定性

Effect of site-directed mutagenesis of r- glutamyl endopeptidase pH tolerance

ABSTRACT

γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2，also known as γ-GT, is widely existed in living body and it can catalyze specifically the breakage of γ-glutamyl which in glutathione . However, the transfer reaction of glutamoyl needs to be conducted under the alkaline condition due to the catalysis of GGT and the wild GGT lacks generally of tolerance of working environment. In order to solve this problem, this project extracte and amplificate ggt B.subtilis NX-2 gene,constructing pET-22b-Bgg recombinant expression vector. By analyzing the composition of residue on the active surface of wild GGT’s large subunit and small subunit; conducting the site-directed mutagenesis of BGGT genome and compounding the mutant gene in advantage of PCR mediator as well as expressing in the E. coli expressing system. Pairwise combinations studied mutant enzyme catalytic properties and stability under different PH's, which found that the stability of the performance is a combination of good mutant D46V-E502V, Y280V-E502V, D46V-Y280V ，these three groups of mutants . In terms of pH stability，the enzyme activity of D46V-E502V、Y280V-E502V residual nearly 40% after incubate under the conditions of pH11.0 3h，that was 1-flod compared with 20% of wild GGT.

Key words : γ-glutamyl endopeptidase PCR site-directed mutagenesis PHstability

目录

摘 要 II

ABSTRACT III

第一章 文献综述 1

1.1 γ-谷氨酰转肽酶的简介 1

1.2 GGT的结构 1

1.3 GGT的催化机制 2

1.4 提高寡聚酶稳定性的方法 3

1.4.1 酶的固定化法 3

1.4.2 蛋白质工程方法——定点突变法 3

1.5 研究内容与意义 4

第二章 构建表达载体选择突变位点及pH稳定性研究 1

2.1 实验材料 1

2.1.1 菌株和质粒 1

2.1.2 实验试剂 1

2.1.3 实验仪器 2

2.1.4 主要溶液的配制 2

2.2 实验方法 3

2.2.1 构建重组BL21-Pet-22b-Bggt克隆载体 3

2.2.2 突变位点的确定 6

2.2.3 PCR定点突变野生型GGT 6

2.2.4 粗酶液的制备 7

2.2.5 突变酶与野生型GGT的分离纯化 8

2.2.6 SDS-PAGE鉴定 8

2.2.7 检测PH对酶活影响 8

2.2.8 检验pH稳定性 8

第三章 实验结果 9

3.1 重组表达载体PET-22B的构建与鉴定 9

3.1.1 野生型GGT的PCR扩增 9

3.1.2 重组质粒pET-22b-GGT的双酶切、单酶切验证 9

3.1.3 重组质粒pET-22b-Bggt的PCR验证 10

3.1.4 pET-22b-Bggt基因序列测定 10

3.2 定点突变位点的选择 11

3.2.1 同源建模 11

3.2.2 候选位点的选择 12

3.3 SDS-PAGE验证结果 14

3.4 最适反应pH 14

3.5 pH稳定性 15

3.6 突变酶和野生酶的pH失活曲线、失活动力学参数的测定 16

第四章 实验结论 19

参考文献 20

致谢 22

文献综述

1.1 γ-谷氨酰转肽酶的简介

γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2），是生物体内广泛存在的谷氨酰代谢循环的关键酶，参与谷胱甘肽（GSH）的代谢，并参与谷胱甘肽和氨基酸的跨膜运输，具有转肽、自转肽、水解3种催化作用。随着对GGT酶的深入了解，GGT的催化功能以及分子结构被广泛认知，利用其转肽特性,可生物合成一起重要的化合物如谷胱甘肽、谷胱二肽和茶氨酸等。^[1]酶的酰基化和脱酰基化是当中的两个步骤。GGT的有催化功能较强的位点特异性过程，且其产物光学纯度高，反应不需要保护或脱保护反应物，不消耗ATP，因此利用GGT酶法生物合成已然成为一些化合物合成的研究热点。但其中有个弊端就是这种酶的pH稳定性较差。

酶在碱环境下易失活，这点限制了酶制剂工业生产和应用，因此如何提高酶在工业环境下的稳定性是最近生物化学领域研究的一个火热项目。根据现阶段的研究得出以下几个方法提高其稳定性：固定化、化学修饰、基因工程技术、添加稳定剂。其中固定化、添加稳定剂、化学修饰已相对有了一些研究进展。^[2]

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