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摘 要

本课题对铜绿假单胞菌浓缩型发酵剂的制备和保藏进行了研究。浓缩菌剂的制备中，采用真空冷冻干燥的方法，对不同冻干保护剂的冻干效果和最适加入量进行了优化，考察了不同起始菌浓对冻干效果的影响。结果表明，乳糖的冻干保护效果较好，优化确定了乳糖的最适浓度为15%（m/v），发酵剂最佳起始菌浓为将发酵液进行100倍浓缩，冻干后菌体的存活率可达到27%，最终菌粉浓度可达2.3×10¹²CFU/g。分别对常温和4℃保藏条件下铜绿假单胞菌浓缩型发酵剂和普通甘油保藏的效果进行了考察，结果显示，常温和4℃下普通甘油保藏效果均不佳，浓缩型发酵剂的冻干菌粉在4℃下保藏效果较好，6个月后，可使菌粉浓度可达到1.6×10¹²CFU/g，菌体存活率约为64%。

关键词：铜绿假单胞菌 真空冷冻干燥法 浓缩菌剂 冻干保护剂

The preparation of pseudomonas aeruginosa bacteria enrichment agent

ABSTRACT

The preparation and preservation of Pseudomonas aeruginosa concentrated starter was studied,different freeze protection and the optimum adding amount of agent was optimized by using vacuum freeze drying, the influence of different initial bacteria concentration was investigated.The rusults showed that lactose was the best freeze-drying protective agent and the optimum adding amount was 15%,the optimal initial bacteria concentration fermentation agent was 100 times concentrated the fermentation liquid ,which can make the survival rate reach 27%,make the bacteria counts reach 2.3×10¹²CFU/g . Concentrated starter and ordinary glycerin protection of Pseudomonas aeruginosa was preserved at room temperature and 4℃ for several months. The results showed that, ordinary glycerin protection of Pseudomonas aeruginosa was not good at both room temperature and 4℃, concentrated starter lyophilized bacteria powder can make the bacteria powder concentration reach1.6×10¹² CFU/g, cell survival rate was about 64% when preserved at 4 ℃.

Key Words: Pseudomonas aeruginosavacuum；freeze drying；Enrichment inoculants；Freeze dried protection

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1微生物采油技术简介 1

1.1.1传统采油方法 1

1.1.2 微生物提高原油采收率技术 1

1.1.3 MEOR的分类 1

1.1.4 国内外微生物采油技术的发展历程 2

1.1.5 MEOR的作用机理 3

1.1.6 MEOR菌株的来源及特点 4

1.2 铜绿假单胞菌 5

1.2.1 铜绿假单胞菌简介 5

1.2.2 铜绿假单胞菌在采油行业中的研究与应用 5

1.3 浓缩型发酵剂的研究 6

1.3.1 浓缩型发酵剂简介 6

1.3.2 浓缩型发酵剂的种类 6

1.3.3影响冻干发酵剂制备的主要因素 6

1.3.4 浓缩型发酵剂的研究与应用 8

1.4 研究目的与内容 8

1.4.1 研究目的 8

1.4.2 研究内容 8

第二章 铜绿假单胞菌浓缩菌剂制备的研究 9

2.1 实验材料与仪器设备 9

2.1.1 菌株 9

2.1.2 主要试剂和仪器 9

2.1.3 培养基 10

2.2 实验方法 10

2.2.1 培养方法 10

2.2.2 发酵液稀释方法——十倍梯度稀释 10

2.2.3 菌浓测定方法——活菌计数法 10

2.2.4 冻干或离心后菌体存活率计算方法 11

2.2.5 甘油保藏方法 11

2.2.6 冻干保护剂的选择 11

2.2.7 起始菌浓的选择 11

2.2.8 冻干条件 11

2.2.9 真空冷冻干燥及保藏 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 甘油保藏法的保藏效果 13

3.2冻干保护剂的选择 14

3.3 起始菌浓对冻干效果的影响 15

3.4 冻干保护剂的优化 16

3.5不同条件下铜绿假单胞菌浓缩菌剂的保藏效果 17

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1微生物采油技术简介

在世界范围内，使用常规采油技术，经一次采油、二次采油后只能开采出地下油藏的少部分原油，经过注水或注气后，几乎还有60% ~70%的原油仍然滞留在油藏中^[1]。如何有效提高原油采收率，是困扰原油开采的重大难题。

1.1.1传统采油方法

采油方式的选择是油田开发和开采过程中的重要步骤，合适的开采方式能在充分发挥油井性能的前提下，缩短油田开发周期，降低原油开采成本。因此，非常有必要在油田开发的不同阶段，选择该阶段最适的开采方式且在不同阶段转换不同的采油方法。常用的采油工艺主要有注水采油法、注气采油法、蒸汽吞吐采油法、火烧油层法等传统水驱、气驱和热力驱方法^[2]。

1.1.2 微生物提高原油采收率技术

微生物提高原油采收率技术(MEOR)是继传统二次、三次采油技术之后的利用微生物细胞本身直接作用于原油或产生有利的代谢产物来开采石油的一种廉价有效的方式^[3]。和其他技术相比，微生物采油具有经济效益好、见效周期长、不损伤油层和无污染无毒害等优点^[4]，MEOR所需设备简单，采用传统的注水地面设备即可达到施工要求，因此对边际油田更具有吸引力，是目前最具有发展前景的一项采油技术^[5]。

但MEOR也存在自身的不足，如不同地层条件下微生物采油机理不清晰、注入的菌液或营养激活剂促使地层水中原本含有的硫酸盐还原菌等其他菌类大量生长带来的酸蚀油井的危害、细菌迁移、微生物使注入的化学药品发生生物降解等诸多问题^[6]。研究指出微生物采油更适合于我国小于40℃的低温油藏、含蜡油藏、普通稠油油藏或含水率小于80%的断块小油藏^[7]。

1.1.3 MEOR的分类

根据MEOR菌种的来源不同，可将微生物采油分为内源微生物采油和外源微生物采油。内源微生物是指油藏中较为稳定的微生物群落，多数是在油田水驱开发过程中由地表带入的且已经适应油田地层环境的微生物，也有油藏形成过程中

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