论文总字数：21848字

摘 要

细胞对酸胁迫的抗性差是传统发酵工业节能减排的关键共性问题。绝大多数工业微生物的耐酸研究都集中在大规模的诱变和筛选，研究周期长、工作量大，且属于暗箱操作，不能根据目标表型获得相应的基因型。因此，研究微生物酸耐受性机制，提高微生物对酸耐受性十分重要。

本实验采用连续传代的传统实验室适应性进化方法，以得到突变菌株，并对该突变菌株的耐酸性能在细胞层面做进一步的研究。首先，通过双阶段短期脉冲实验，经过连续传代40天，菌株rpoD在低pH筛选压力下，其OD₆₀₀有着明显的提升，获得了有一定的耐低pH性能的突变菌群。 从中提取出来的质粒，转化进入DH5α ,将质粒trpoD用热激法转化DH5α，得到突变菌株E.coli DH5α-trpoD。实验表明，传统实验室进化方法能改善大肠杆菌的耐低pH性能。经过对突变菌株细胞层面的初探，结果显示，菌株trpoD生长优于其他对照菌株，且在pH为4.0时生长性能最好，具有一定的耐酸性能。

关键词：传代培养，耐酸性，大肠杆菌，rpoD

Continuous transmission of E. coli resistant to

impact on the performance of the low pH stress culture

ABSTRACT

The poor resistance of cells to acid stress is the key problem of the traditional industrial energy saving and emission reduction. The vast acid of most industrial microorganisms are concentrated in the large-scale mutagenesis and screening, long cycle, heavy workload, and belong to the black box operation, not according to the target phenotype obtained the corresponding genotype. Therefore, it is very important to study the mechanism of microbial acid tolerance and improve microbial tolerance to acid tolerance.

In this experiment, the adaptive evolutionary method of continuous generation was used to obtain the mutant strain and the resistance to the mutant strain was further studied at the cell level. First, through a two stage of short pulse experiments after 40 days of continuous passage, strain rpoD in low pH selection pressure, the OD₆₀₀ has a significantly improved, have certain resistance to low pH properties of mutated flora.From the plasmid, the plasmid was transformed into DH5α, and the plasmid trpoD was transformed to DH5α by heat shock, and the mutant strain E.coli DH5α was obtained by -trpoD. Experiments show that the traditional laboratory evolution method can improve the low pH performance of E.coli. The results showed that the growth of the strain trpoD was better than that of the other control strains, and the growth performance of the strain pH was the best when was 4, and had a certain acid resistance.

Key words: subculture, acid resistance, E. coli, rpoD

目录

摘 要..............................................................I

ABSTRACT ........................................................II

第一章 文献综述.................................................... 1

1.1 传统发酵工业节能减排的共性问题——细胞对酸胁迫的抗逆性差 ....... 1

1.2 全局转录调控为工业微生物菌株的改造提供新的策略.................. 1

1.3 大肠杆菌........................................................ 4

1.3.1 大肠杆菌的来源.............................................4

1.3.2 大肠杆菌的特征.............................................4

1.4 菌株连续传代培养............................................ 5

1.5 大肠杆菌耐低pH胁迫性能研究概括..............................5

1.6 微生物实验进化研究.......................................... 5

1.7 本实验研究的目的及意义...................................... 7

第二章 实验材料与方法.............................................. 8

2.1 材料与仪器...................................................... 8

2.1.1 菌株来源...................................................8

2.1.2 主要试剂...................................................8

2.1.3 主要仪器设备.............................................. 8

2.1.4 主要溶液成分与培养基.......................................9

2.2实验方法.........................................................9

2.2.1 热激法.....................................................9

2.2.2 重组质粒转化DH5α........................................ 10

第三章 结果与讨论..................................................11

3.1 连续传代方法提高大肠杆菌的耐低pH的性能.................... 11

3.2 突变菌的分离纯化........................................... 12

3.3 突变菌株细胞层面的耐低pH的初探............................ 13

附录：突变片段trpoD氨基酸序列..................................... 17

第四章 结语........................................................18

参考文献...........................................................19

致 谢...........................................................22

第一章 文献综述

1、传统发酵工业节能减排的共性问题——细胞对酸胁迫的抗逆性差

发酵产业是我国生物产业的重要组成部分，其产品遍布医药、食品、化工、农业、材料、能源等众多领域，在国计民生中占据极其重要的地位。其中，近年来发展迅速的有机酸、氨基酸发酵产业已成为我国发酵产业的一个成熟的分支。2012年，我国氨基酸产量达330多万吨，年产值近500亿元，产量上占世界总产量的50%以上；同时，我国柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、衣康酸等大宗有机酸的产能在全球也占极大比重，是名副其实的“世界工厂”。

然而，我国有机酸、氨基酸产业在生产的经济性、环保性等方面尚存在诸多亟待解决的问题。现代大规模工业发酵生产一直追求达到更高的发酵终产物浓度，而工业微生物菌种耐酸胁迫性能差，发酵终产物浓度低，导致下游分离成本居高不下，成为制约整个工业发酵产业链的瓶颈。由于酸性发酵终产物导致了不利于细胞正常生长代谢的胞内微环境，为维持工业生产过程的稳定性，需要应用外源中和剂实施pH干预。比如谷氨酸生产中一般通过补加氨水将pH控制在7.0左右，待发酵结束后再加入浓硫酸使pH降至3.2左右以利于氨基酸提取。若将生产菌株的耐酸胁迫性能从原始的pH 6.0提升至pH 4.6，则能显著减少中和剂的使用，降低下游污染。此外，为避免染菌及降低成本，人们希望采用酸性发酵工艺，这要求菌株具有耐低pH的能力。因此，工业微生物的耐酸胁迫能力有助于提高发酵工业过程的经济性和绿色指数^[1]。本实验以大肠杆菌为模式菌株，以低pH为筛选压力，将提高该菌株耐酸胁迫能力为研究重点，初探其耐酸机制，为进一步提升工业菌株耐酸胁迫能力，解析其耐酸分子机制研究奠定基础。

2、全局转录调控（Global Transcriptional Machinery Engineering）为工业微生物菌株的改造提供新的策略

在实际应用中，最常用的进化工程手段是物理化学诱变技术。通过物理或化学诱变剂处理细胞，造成胞内的DNA随机损伤，增加细胞的随机突变率，从而加速细胞适应性进化能力。这种诱变剂育种方法，瞬间提高细胞的随机突变率，虽然育种速率快，但是对基因DNA的大范围破坏，造成大量的有害突变，往往会降低细胞其它生理表型。另一种常用的进化工程方法，是细胞自发的适应性进化，即在非适宜环境中经过长时间的连续传代，驯化细胞，筛选生长速率越来越快的突变菌，可以同步筛选出目标产物生长速率、产率和终浓度均显著提高的突变菌（见图一）^[2]。Ingram研究小组利用此技术，成功提高了大肠杆菌发酵生产乙醇、L-乳酸、D-乳酸等化合物的生产性能，产量可提高1-2个数量级^[3]。因此，本实验选用连续传代这一常用的实验室进化方法作为研究方法。

图1 常用实验室进化方法

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