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摘 要

羰基还原酶是一种具有高度的化学、区域和立体选择性的生物催化剂，常用于生物转化合成具有光学活性的不同种类的手性化合物，其中手性醇作为羰基还原酶应用中最重要的产物，因为其在医学、农药和功能材料领域中有很重要的关键作用。采用化学法制备手性醇存在效率低、ee值低、环境污染大等不足，改用酶催化具有ee值高、反应条件温和及环境友好等优势。手性醇的广泛应用，导致其需求远大于目前的生产水平，所以如何大量低成本的生产羰基还原酶，来填补手性醇的生产空缺就成为目前需要解决的问题了。所以我们对实验室已改造的一株带有羰基还原酶基因的重组菌进行发酵条件优化及放大培养，确定了采用对生生长后期的菌种进行发酵培养，确定了诱导培养的时间为17h。逐级放大至7t发酵罐，最高酶活达到13504.3，已经初步达到工业化生产的要求。

关键词：羰基还原酶 高密度培养 大肠杆菌 发酵

The fermentation and amplification of the bacillus gene engineering bacterium with carbonyl reductase

Abstract

Carbonyl reductase is a biocatalyst with high chemo-, region-, and stereospecificity, and widely used in biosynthesis of chiral compounds which is a very important key role of medicine, pesticide and so on. However, traditional chemical synthesis of chiral compounds has many disadvantages, such as low efficiency, low ee value, high environmental pollution, etc. Biosynthesis of chiral compounds has overcome these shortcomings. Therefore, a large scale low-cost  production of carbonyl reductase become a problem which needed to be solved at present. So conditions optimization and scale-up culture of E.coil with carbonyl reductase gene from our laboratory had been studied. The results showed that the activity was highest after cultivating 17 hour. The enzyme activity reached 13504.3, which already meet the requirements of industrial production.

Key Words: Carbonyl reductase; E.coli; High density cultivation; Fermentation

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1. 1 生物制造 1

1.2 大肠杆菌 1

1.3 羰基还原酶 2

1.3.1 羰基还原酶在手性醇生产中的应用 2

1.3.2 羰基还原酶在手性醇生产中的应用前景 2

1.3.3 高密度培养 3

第二章 实验材料 4

2.1 实验仪器 4

2.2 实验药品 5

第三章 实验方法 7

3.1 菌株 7

3.2 摇瓶培养 7

3.2.1 摇瓶培养基 7

3.2.2 实验步骤 7

3.3 发酵罐培养 8

3.3.1 发酵罐培养基 8

3.3.2 实验步骤 9

3.3.3 酶活测定方法 10

3.4 诱导培养 11

3.5 逐级培养...........................................................................................................................10

第四章 实验结果与讨论 14

4.1 生长曲线的测定 14

4.2 种龄对发酵的影响 14

4.2.1 种龄对OD的影响 14

4.2.2 种龄对酶活的影响 15

4.3 诱导培养时间对发酵的影响 16

4.3.1 诱导培养的生产曲线 16

4.5 逐级放大 17

第五章 结论与展望 18

参考文献 19

致 谢 20

第一章 文献综述

1.生物制造

随着现代社会的发展，人口的增长，我们对各类物品的需求也越来越高了，于是有了生产和需求的矛盾，尤其是生产效率不高，不易生产的产品更是供不应求。所以如何高效、简易的生产出需要的产品就刻不容缓了。但是传统的工业生产方法污染严重，能源消耗大，生产效率低，不再适合现代社会。相比较传统的工业方法^[1]，新起的生物生产方法具有以下特点：

①采用生物催化剂，反应一般在常温常压下进行；

②采用可再生资源，如蛋白质，碳水化合物等；

③生产设备简单，能源消耗较少；

④酶反应专一强，转化率高，发酵成本低。^[2,3]

因此生物生产是一种友好性质的生产技术，在保护环境、节约能源、造福人类方面具有极大的价值，更加适应现在社会的需要。而进行生物制造的催化剂即为生物酶或者微生物细胞。

2.大肠杆菌

大肠杆菌（学名：Escherichia coli，通常简写：E. coli）是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%^[4,5,6]。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B和K，对人体有益。在现代生物学研究中，大肠杆菌是研究最多的一种细菌，因为其基因序列已经全部被测出，所以当作一种模式生物。用分子生物学方法在大肠杆菌得出的结论可用于其它生物的研究。所以，在生物工程中，大肠杆菌被广泛用于基因复制和表达的宿主。

野生大肠杆菌（E.coli）的基因组DNA中有470万个碱基对（bp），内含4288个基因，E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组分的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有可塑性^[7,8,9]。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或者缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型（Phenotype），把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。这些不同基因型特性的菌株在基因工程的研究和生产中具有广泛的应用价值。

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