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摘 要

本文主要探究定点突变技术对枯草芽孢杆菌中γ-谷氨酰转肽酶热稳定性的影响。主要工作是从B.subtilis NX-2 菌株中提取GGT基因组，PCR扩增，同时从大肠杆菌中提取PET-22B质粒，构建PET-22B-BGGT表达载体，在此基础上确定D46V、T201V、Y280V、E502V4个突变位点，设计突变引物，利用PCR介导对BGGT基因组进行定点突变，导入大肠杆菌BL-21中诱导表达，提取BGGT粗酶液纯化后，发现D46V突变酶较野生型酶在偏碱环境下的稳定性变化不大，T201V、Y280V在偏碱环境下的稳定性反而降低，E502V在偏碱环境下的稳定性较野生型酶有明显提高。

关键词：γ-谷氨酰转肽酶 定点突变 PCR技术 稳定性

The study of site-directed mutagenesis to improve the stability of γ- glutamyl endopeptidase in alkaline solution

ABSTRACT

The objective of the present research work was to explore the impact of site-directed mutagenesis technology on the thermal stability of γ-glutamyl endopeptidase in Bacillus subtilis.The main job is to extract GGT genome from the B.subtilis NX-2,PCR amplification, and extracted PET-22B from the E. coli plasmid to construct PET-22B-BGGT expression vector. On the basis, identified four mutation sites: D46V, T201V, Y280V , E502V and design the mutated primers. Using PCR mediated site directed mutagenesis of BGGT genome, induced in E. coli BL-21. The experimental results showed that the the stability of D46V mutant enzyme isn’t much different form the wild-type enzyme in alkaline solution. T201V and Y280V mutant enzyme have lower stability but compared to the wild -type enzyme,the stability of E502V has significantly improved.

Key words:γ-glutamyl endopeptidase;site-directed mutagenesis;PCR technology;thermal stability

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 γ-谷氨酰转肽酶 1

1.2 提高酶稳定性的方法 1

1.3 本课题的研究内容及意义 3

第二章 实验材料与方法 4

2.1 实验材料 4

2.2 实验方法 7

2.3 重组质粒pET-22b-GGT的双酶切、单酶切验证 12

2.4 定点突变 13

2.5 突变酶的粗酶液提取 15

2.5.1 重组BGGT的分离纯化 15

2.6 重组BGGT在碱液中的PH稳定性研究 16

2.6.1 酶活力测定 16

2.6.2 蛋白浓度的测定 17

2.6.3 重组BGGT的酶学性质研究 17

3.1 突变质粒测序结果分析 19

3.2重组BGGT的分离纯化 19

3.2.1 重组BGGT的亲和纯化 19

3.2.2 重组BGGT纯化后的蛋白电泳结果 20

3.3 BGGT酶学性质研究 21

3.3.1 pH稳定性 21

3.3.2 最适反应pH 22

3.3.3 催化常数的测定 23

3.3.4突变酶和野生型酶PH失活常数的测定结果讨论 24

参考文献 28

致 谢 30

文献综述

1.1 γ-谷氨酰转肽酶

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)可特异性地将γ-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含γ-谷氨酰基的化合物。该反应包括了酶的酰基化(Acylation)和脱酰基化(Deacylation)两个步骤，通过改变受体种类，可制备一系列重要的谷氨酰化合物，如谷胱甘肽、谷胱二肽和茶氨酸等。

由于该过程位点特异性和光学选择性强，无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程中不消耗ATP。因此，GGT催化的谷氨酰基化反应已成为生物催化领域的研究热点。但在该酶的实际应用中却发现其热稳定性较差，在55 ℃下GGT的酶活半衰期仅有90 min。

酶的热失活是限制酶制剂工业生产和应用的重要因素，如何提高酶在工业环境下的稳定性是近年来生物化工领域研究的热点。目前，提高酶稳定性方法主要有：固定化法、化学修饰、基因工程技术、添加稳定剂法。固定化法、添加稳定剂法、化学修饰法已有相关研究发表[1]。蛋白质的热稳定性是其所有共价和非共价结合力的综合体现，影响因素较多，包括疏水作用，氢键、盐键及共价键的稳定等，一般考虑降低折叠与非折叠的熵差，以减少非折叠的构象；通过残基替换稳定Ⅱ一螺旋及环等二级结构；增强疏水内核；增加残基间的氢键数。在基因工程领域，也有人做了定点突变提高里氏木霉木聚糖酶(XYN II)的稳定性的研究[2]。从E.coli GGT晶体结构的研究表明，GGT是由大、小两个亚基组成的异源二聚体蛋白，酶分子中与供体结合密切关联的氨基酸残基，如Arg-114N η、Ser-462O γ、Ser-463 N 和Ser-463O γ分别位于不同的亚基，亚基结构的稳定性是保证GGT活性的关键。而多亚基酶分子的热失活往往是由于亚基解聚造成的[3-5]。所以，本课题以定点突变对γ-谷氨酰转肽酶的热稳定性的影响为研究目的,用定点突变使GGT外围的亲水氨基酸突变成疏水氨基酸，从而改变它的稳定性。

1.2 提高酶稳定性的方法

1.2.1 固定化法

根据固定酶材料与酶分子之间结合力的不同，可分为化学法和物理法。化学法又可分为交联法和共价结合法。交联法需要双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，从而把酶束缚在固体材料上。共价结合法是通过酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法。化学法所得的固定化酶与载体连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其它固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。物理法分为吸附法和包埋法。吸附法主要通过范德化力固定酶，把酶吸附在材料表面或内表面。 包埋法将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化，适合小分子底物的催化反应。两种固定化方法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落并污染催化反应产物等[8]。

1.2.2 化学修饰法

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