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摘 要

提高酶的热稳定性是酶工程研究的一个重要目标。根据Suzuki提出的“脯氨酸效应”理论，在蛋白分子柔性较高的区域将Gly突变为Pro可以显著提高蛋白的稳定性。枯草芽孢杆菌脂肪酶A（BSLA）分子量最小、结构最清晰的常温脂肪酶。

本研究采用分子动力学模拟的方法选取BSLA的第52和158位的Gly作为突变位点引入Pro，并通过分子生物学实验进行相应的定点突变和酶学性质验证。结果表明突变体LipA^G52P、LipAG158P的比活力分别是野生型LipA的5.6倍和2.7倍，Tm值分别提高了15℃和7℃，并且催化效率分别提高了85%和22%。

关键词：枯草芽孢杆菌脂肪酶，分子动力学，脯氨酸理论，定点突变，热稳定性

ABSTRACT

Improving enzyme thermostability is an important goal of enzymatic engineering studies. According to "Effect of Proline" Suzuki proposed theory, the higher the protein molecules of the flexible region is mutated to Pro Gly can be significantly improved stability of the protein.

Bacillus subtilis lipaseA (BSLA) is a normal temperature lipase with both the smallest molecular weight and clear molecular structure

This study used molecular dynamics simulation method selected in Gly 52 and 158 as mutations introduced Pro, and the corresponding site-directed mutagenesis and verified by enzymatic properties of molecular biology experiments. The results showed that the mutant LipAG52P, LipAG158P specific activity of wild-type LipA were 5.6 times and 2.7 times, Tm values were increased by 15 ℃ and 7 ℃, and the catalytic efficiency increased by 85% and 22%.

Keywords ：Bacillus subtilis lipase ;Molecular Dynamics ;Proline theory Directed mutagenesis; Thermal stability;

摘要 1

第一章 引言 4

1.1 课题研究背景 4

1.1.1脂肪酶概述 4

1.1.2 枯草芽孢杆菌脂肪酶A概述 5

1.1.3 脯氨酸 (Pro) 残基在蛋白质结构及其热稳定性中的作用 6

1.2 课题研究的目的和意义 6

1.3 研究思路和技术方法 7

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验菌株 7

2.1.2 载体质粒 7

2.1.3 培养基 8

2.2实验方法 8

2.2.1突变体的获得 8

2.2.2脂肪酶A的表达 9

2.2.3 蛋白质的分离纯化 9

2.2.4酶活力测定 9

2.2.5蛋白浓度测定 10

2.2.6 热稳定性测定 11

2.2.7 动力学参数测定 11

2.2.8分子动力学模拟 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 BSLA的三维模型 12

3.2 突变位点的选择 12

3.3 分子动力学模拟预测突变体的稳定性 13

3.4突变体的获得 15

3.5酶学性质及动力学参数测定 16

3.6热稳定性分析 18

第四章 总结 19

参考文献 20

致谢 22

1. 引言

1.1 课题研究背景

1.1.1脂肪酶概述

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯。脂肪酶通常被用于在非水相体系中催化油脂及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成等反应，由于其高效专一、反应条件温和等特点，已被应用于化工、食品、制药等领域。

1.1.2 枯草芽孢杆菌脂肪酶A概述

枯草芽孢杆菌分泌的脂肪酶A是一类在食品、医药、化工等领域具有良好应用前景的生物催化剂。其是第一个获得晶体结构解析的芽孢杆菌脂肪酶，它的酶学性质、催化机理、稳定性以及立体选择性是近年来研究的热点。由于其在食品、医药、化工等领域具有良好的应用前景，作为生物催化剂而日益受到广泛关注。野生型BSLA存在表达量低、立体选择性差等问题。近年来，通过定向进化和迭代饱和突变等分子生物学手段对BSLA进行改造，提高其立体选择性已成为研究热点。

脂肪酶的活性中心是疏水性的，通常被一层称为“盖子结构”的亲水氨基酸所覆盖，当在油水界面时，盖子会打开，将活性中心暴露出来，与有机相中的底物相结合。多数脂肪酶的催化中心是由 Ser-His-Asp（ 图1-1）Ser参与组成活性中心催化三联体，这一结构特征与真菌脂肪酶Candida antarctica脂肪酶 B（CALB）很相似，这表明LipA更接近于真菌脂肪酶而不是细菌脂肪酶。正是由于LipA独特的分子结构，使得其在手性药物中间体拆分领域具有巨大潜力，已在工业生产和实验室研究中被广泛关注[4]。然而，LipA是一个常温酶，最适温度仅为25℃，野生型的LipA在50℃下的活力就仅为最适温度下的一半。较差的热稳定性已经阻碍了它在工业生产中的进一步应用，但是也为它的稳定性改造提供了进化空间，也使得LipA成为了一个理想的改造对象。

图1-1

酶的热稳定性是酶的重要属性之一，热稳定性酶具有提高化学反应速率、简化工艺、降低成本、提高产品质量、活性稳定、耐贮藏等优点。因而寻找耐温性酶，提高酶的热稳定性一直是生产和科研关注的热点。虽然目前已经有大量的关于酶热稳定性改造研究的报道，但是传统的理性设计方法受到蛋白质结构及功能关系复杂性的限制，而非理性设计方法则需要面临筛选容量大、过程复杂等难题，这两种方法各自的缺点在一定程度上限制了蛋白质改造领域的工作进展。

1.1.3 脯氨酸 (Pro) 残基在蛋白质结构及其热稳定性中的作用

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