一种由量子点标记适配体和氧化石墨烯组成的荧光探测器,用于测定脂多糖内毒素外文翻译资料
2022-08-06 09:53:04
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一种由量子点标记适配体和氧化石墨烯组成的荧光探测器,用于测定脂多糖内毒素
摘要
内毒素是一种复杂的脂多糖(LPS),是革兰氏阴性菌外细胞膜的关键成分。作者报道了一种荧光探针法测定革兰氏阴性菌的脂多糖。用CdSe/ZnS量子点荧光标记抗LPS的适体,加入氧化石墨烯(GO)后其荧光发射被淬灭。当添加LPS时,适配体与LPS结合并释放氧化石墨烯。这导致荧光的恢复,通常在激发/发射波长495/543 nm处被测量到。探测器对10-500 ng mL-1浓度范围内的LPS有反应,检出限为8.7 ng mL-1。该方法可用于在有生物干扰的情况下,对不同革兰氏阴性菌的脂多糖进行选择性检测。
关键词:生物传感器 革兰氏阴性菌 DNA 荧光淬灭 共振能量转移 CdSe/ZnS量子点 荧光启动 受体
简介
脂多糖(LPS)是食品和药品中的重要污染物,其含量是世界各国食品药品监督管理部门严格控制的指标。因此,LPS的检测在制药质量控制、医疗保健和食品工业中受到了极大的关注[1,2]。
亮点
1.将QDs标记的适配体与氧化石墨烯结合构建荧光探测器。
2.GO- aptmer - qd探测器可以识别并与LPS结合,释放氧化石墨烯,恢复荧光。
3.所构建的探针能灵敏地检测出低LOD 8.7 ng mL-1 注射剂中的脂多糖。
酶解鲎试剂( LAL)[3-5]是目前常用的检测LPS的方法。然而,由于其对pH值和温度的依赖性,重复性较低,以及过量采血导致大量马蹄蟹死亡,这些都是LAL检测的主要局限性[6,7]。
许多无酶检测LPS的方法已经被开发出来,其中基于生物传感器的LPS分析由于其高灵敏度和简单的实验程序[7]而受到更多的关注。按其转导形式可分为两大类:电化学检测和光学检测。电化学传感具有灵敏度极高的优点[8-11],如果结合适体探测器和金原子簇修饰金电极,LPS的检出限可低至7.94 times; 10-21 M[9]。
光学LPS生物传感器通常基于荧光和表面等离子体共振(SPR)的测量。基于SPR,银纳米颗粒(AgNPs)-多粘菌素B (PMB)胶态体系[12,13]用于检测尿液和中药注射剂中的脂多糖。基于荧光的LPS传感器主要用于合成荧光标记的配体,这些配体可以区分和结合LPS。荧光共振能量转移(FRET)是一种灵敏的探测读出器,LPS结合在探针上引起构象改变,导致荧光恢复。在离子对相互作用的基础上,合成了肽功能化的聚二乙炔脂质体[14]和四苯乙烯[15]作为LPS的荧光激发传感器。配体结合适配体和基于肽段的LPS荧光传感器具有更强的强健性和特异性。利用来自CD14[16]的LPS结合域的多肽构建了检测限为20 mu;g mL-1 的FRET传感器。氧化石墨烯(GO)具有较高的荧光猝灭效率[17]。当用于生物分子检测的荧光探针时,染料标记的配体通过pi;-pi;叠加相互作用组装在表面上,靶标与配体的偶联使氧化石墨烯的释放诱导荧光恢复。四甲基罗丹明标记肽组装氧化石墨烯(GO)荧光启动传感器[18]使LPS的检测限降低到1.3 ng mL-1。Zhang等人合成了6-羧基- X -罗明标记的LPS适配体结合氧化石墨烯检测饮料样品中的LPS,其检测限为15.7ng mL-1。
与有机染料相比,量子点具有光漂白阈值高、化学稳定性好、光谱性质可调等优点[20]。QD-GO荧光猝灭系统具有较高的灵敏度和重现性,广泛应用于蛋白质[21]、核酸[22]、细菌[23]、黄曲霉毒素B[24]等生物分子传感。但是,目前还没有关于QD标记的适配体结合氧化石墨烯检测LPS的报道。
因此,我们提出了第一个QD适体GO荧光探针用于LPS的检测。合成了具有LPS结合域的5rsquo;-NH2修饰适体,并用量子点标记。结合GO作为荧光猝灭剂,建立了一种灵敏的LPS荧光检测系统。在优化的条件下,对实际样品中的LPS进行了定量检测。为光学LPS的检测提供了一种新的方法。
实验
材料和试剂
LPS适体(NH--CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAG CCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-) [25] 由上海桑根生物科技有限公司(中国上海)(https://www.sangon.com)合成,高效液相色谱(HPLC)纯化。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC),N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),磷酸盐缓冲盐水(0.01 M,pH 7.4),石墨烯氧化物和LPS从大肠杆菌055:B5,铜绿假单胞菌,和伤寒沙门氏菌购自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)(http://www-sigmaaldrich.com)。水溶性羧基官能团化的CdSe/ZnS量子点的最大发射波长为545plusmn;5 nm,购自武汉佳源量子点有限公司(武汉,中国)(http://www. qds.net .cn)。维生素Bl和0.9%氯化钠注射液购自西南制药有限公司(中国重庆)(hup://www.swp.cn)。所有溶液均由微孔Milli-Q净水系统中电阻率为18.0 M的超纯水制备。所有其他化学品均为分析级,按收到时使用。
采用RF-5301荧光分光光度计(津岛, 日本)(htlps://www.shimadzu.com),150w氙光源,激发光和发射光狭缝宽度为5.0nm。
量子点标记适体的合成
用PBS法制备了1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)(60 mM)、QDs(1 mu;M)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)(30 mM)和胺修饰适体(25 mu;M)的溶液。将80 mu;L EDC和80 mu;L QDs溶液混合,并在25℃下在摇床上搅拌。15min后,加入80 mu;L NHS,搅拌20min,再加入18 mu;L 10 mM 三氯苯缓冲液,搅拌2 h,终止QDs表面未反应的羧基。
收集QDs适体结合物,以12000转/分的速率用PBS洗涤3次,15分钟,以完全去除游离适体。将QD适体悬浮于8 mL浓度为0.8 M的PBS(pH 7.4)中。
QD适体GO探针对LPS作用的荧光恢复
将LPS溶于8.5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500和1000 ng mL-1的超纯水中。使用前,将LPS储备溶液旋涡并摇动至42°C,以避免形成胶束/聚集体。
将500 mu;L QD -Apt溶液(0.8 mu;M)添加到200 mu;L GO(100 mu;g mL-1)溶液中并培养30分钟。然后添加200 mu;L LPS溶液(200 mu;g mL-1)并培养。然后,在25℃下,记录了LPS加入前后不同培养时间下激发/发射波长=495/543 nm的荧光强度。
PBS与维生素B1注射液中LPS的检测
将500 mu;L QD-Apt溶液与200 mu;L GO(100 mu;g mL-1)溶液混合,并将混合物培养30分钟。然后加入200 mu;L不同浓度的LPS溶液500-8.5 ng mL-1,再培养30分钟。通过荧光强度比F/F0与LPS浓度的关系绘制校准图,其中F和F0分别表示有LPS和无LPS时=495/543 nm处的荧光强度。
取市售维生素Bl注射液(C12H17ClN4OSHCl 50 mg mL-1)进行实际样品分析。维生素Bl无菌溶液,pH值2.5-4.0。维生素Bl注射液用PBS(0.01 M,pH 7.4)稀释10倍,然后将其加入到浓度为50, 50, 300, 500和1000 ng mL-1的400 mu;L LPS标准溶液中,定容为2 mL,得到浓度分别为10, 30, 60, 100和200ng mL-1的加标溶液。取200 mu;L加标液进行LPS检测,方法与PBS中LPS的检测方法相同。通过标定曲线计算LPS浓度、峰电位恢复率和相对标准差。
结果和讨论
材料的选择
我们小组长期以来一直致力于病原菌的检测。我们设计了用于大肠杆菌检测的电化学阻抗生物传感器PDDA/AuNP@Ag[26]和Man/MUA-MH/Au[27],以及用于鼠伤寒沙门菌检测的荧光生物传感器CdSc/ZnS-QD-lgG抗体[28]和碳点(CDs)-适体[29]。结果表明,基于适体的荧光传感器具有与抗体传感器相似的特异性,但其制备过程简单。因此,我们现在要设计一种基于QD标记适体的LPS荧光探针,它不同于我们以前的方法CD适体。我们还想引入一个荧光受体来构建一个更敏感的基于FRET的系统。GO具有很高的荧光淬灭效率,通过与碱基的疏水性和pi;-pi;堆积作用对单链DNA有很强的吸附作用,但对双链DNA或二级和三级结构DNA的亲和力较低。因此,我们设计了QD-Apt-GO荧光LPS探针,CdSe/ZnS QDs、适体和GO分别为荧光供体、LPS识别配体和荧光淬灭剂。
量子点DQ-Apt-GO荧光探针的机理
LPS QD-Apt-GO荧光探针的原理如图一所示。合成了具有LPS结合域的氨基修饰单链DNA,并用量子点在N端标记。具有单链构象的量子点适体配合物在溶液中通过pi;-pi;堆积随机吸附到物理上,QD-Apt与GO之间的距离小于10 nm,通过FRET导致荧光淬灭(图1)。加入LPS后,LPS通过范德华力、碱基堆积作用、氢键或静电作用识别并结合单链核酸适体,形成折叠良好的QD-Apt-LPS复合物。适配子嘌呤和嘧啶碱基的占据使QD-Apt和GO之间的相互作用减弱。这导致GO和荧光恢复的重新激活(图1)。加入200 ng mL-1 LPS后,543 nm处的荧光强度在培养30min后增加20倍(图2)。表示QD-Apt-GO探针对LPS浓度变化敏感。该荧光淬灭系统在激发波长495 nm处显示荧光光谱在500~600 nm范围内,最大发射波长为543 nm(图2)。
脂多糖(LPS)检测方法的优化
优化了以下参数:(a)GO用量;(b)QD-Apt与GO的培养时间;(c)QD-Apt-GO与LPS的培养时间;(d)样品pH值。电子支撑材料中给出了相应的数据和图形(图Sl-图S4)。实验结果表明:(a)100 mu;g mL-1 GO;(b)QD-Apt与GO的培养时间为30min;(c)QD-Apt-GO与LPS的培养时间为30min;(d)最佳样品pH值为7.0-8.0。Stern-Volmer图(图S2)显示了0-100 mu;g mL-1范围内的向上曲线形状,这是动态淬灭和静态淬灭结合的特征。
图1量子点QD-Apt-GO荧光探针的机理
QD-Apt-GO对脂多糖(LPS)的选择性和特异性
LAL是LPS的主要检测方法,但其操作条件苛刻,易受beta;-D-葡萄糖或Zn2 、Mg2 、EDTA等离子干扰,导致假阴性结果。此外,对于药物注射剂,活性成分通常以含有Cl-、PO43-和Na 等离子的盐存在。为了研究QD-Apt-GO荧光探针的选择性,研究了EDTA(对LAL的影响),研究了Zn2 、Mg2 、H3PO4、BSA、DNA和beta;-D-葡萄糖(LPS的功能组)(图3)。值得注意的是,即使在100倍于LPS的浓度下,所有这些干扰因素对荧光强度比F/F0也没有显著影响(图3黑柱)。相反,在这些干扰剂中加入500 ng mL-1 LPS溶液后,荧光恢复发生,F/F0变化至少10倍(图3灰色柱)。
在未经任何预处理的情况下,对0.9% NaCl注射液中的LPS进行了检测。如图3所示,0.9% NaCl注射液的F/F0变化不大。因此,这种QD-Apt-GO-LPS探针对LPS具有高度的选择性,即使在存在干扰物和真实的药物注射样品中也是如此。
为探讨该QD-Apt-GO探针是否能检测其它革兰氏阴性菌的LPS,将从大肠杆菌、铜绿假单胞菌和伤寒沙门菌中纯化的200 ng mL-1脂多糖添加到探针溶液中。结
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