文 献 综 述

1、海藻糖简介

海藻糖，素有”生命之糖”的美誉，是伞形正成熟果实中主要的可溶性糖类，在蕨类中代替蔗糖成为主要的可溶性糖类，在昆虫中它是用作能源的主要血循环糖[1]。海藻糖由两个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键构成，属非还原性二糖，无色无嗅，具有很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，对蛋白质、核酸、细胞膜等活体成分有很强的稳定作用，在活体受到外界压力（干燥、冻结、渗透压等）时有保护作用[2]。作为唯一被美国FDA认证为安全的功能性低聚糖，海藻糖以其独特的生物保护能力，在食品、医药保健及精细化学品、化妆品、农业等领域具有广阔的市场前景[3]。

2、目前的生产方法以及发展趋势

目前正在研究和开发的海藻糖制备方法主要有微生物抽提法、发酵法、酶转化法。而从微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很大程度制约着海藻糖大规模工业化生产 [4，5]。发酵法转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制困难，对降低生产成本、促进推广应用等方面很不利[6]。在脂肪肝菌、恶臭假单胞菌以及一些嗜热菌菌株中均发现了海藻糖合酶，该酶是一种分子内葡糖基转移酶，海藻糖合酶能够将麦芽糖直接转化为海藻糖，不作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽寡糖、蔗糖、异麦芽糖、异麦芽寡糖等，且不需要任何辅酶，该酶反应流程短，易控制，不需要磷酸盐共存，海藻糖的产率高且不受底物麦芽糖浓度的影响，因此该酶在海藻糖工业产业中有着良好的应用前景[7]。所以，得到活力较高的海藻糖合酶酶活成为生产海藻糖工业的关键步骤之一，其中利用海藻糖合成酶以麦芽糖为原料的一步酶法生产海藻糖的路线由于工艺简单、易于调控等优势，成为未来工业化生产海藻糖的趋势[8，9]。

3、透性化技术在酶法生产海藻糖中的应用

海藻糖合成酶属胞内酶，传统提取工艺通常先将细胞破碎，经逐级分离纯化后才可使用，酶活损失较大，且操作复杂，设备投资大，制约了其在工业生产中的应用[10]。与传统提取工艺相比，采用通透性处理细胞技术，在不破坏细胞整体内部有机结构的前提下改变细胞壁和细胞膜的通透性, 使得小分子底物能够自由进出细胞膜的技术则有望克服提取法酶活损失大的缺点。常见细胞渗透处理方法有物理法、化学法和生物法，物理法是对细胞膜和细胞壁的结构产生破坏，细胞因膜/壁结构性损伤而提高通透性，常用方法包括低温冷冻、脱水干燥、超声波处理等，物理法在工业生产操作上有一定难度；化学法的渗透机理是试剂透过细胞壁与细胞膜的脂质体进行内反应，破坏膜的结构和脂质体的流动性，使细胞膜失去原有的对胞内外物质传递的调控能力，主要方法包括抗菌素法，去垢剂法、有机溶剂法、螯合剂法等，虽然物理法和化学法已经相对成熟，方法的种类也多种多样，但他们均在一定程度上对所处理的细胞或菌体产生损伤，相比而言，生物法的处理和操作都较为温柔，细胞透性化技术可以在不破坏细胞整体邮寄系统的情况下改变细胞的通透性从而克服细胞膜的渗透屏障，降低细胞外质的传质阻力，使胞内酶在稳定的细胞内环境中发挥作用，能够提高其稳定性和催化效率，细胞透性化技术方法简便，将其应用在海藻糖的生产具有一定的优势[11]。

张峻等在研究海藻糖酶法合成工艺实验时，系统对比了甲苯、氯仿、乙醇、吐温、溶菌酶等试剂对亚栖热菌CBS-01菌体细胞的渗透效果，发现氯仿和甲苯对CBS-01菌体细胞的渗透效果较好，所得透性化细胞海藻糖合酶的表观活性均可达到原细胞（对照）的100倍以上，氯仿或甲苯与EDTA或乙醇对CBS-01菌体细胞通透性的增加没有协同增强作用，在对细胞进行渗透处理时，从设备、生产成本等角度考虑，处理体积越小越好，为了尽可能提高待处理的菌悬液浓度，实验中不同甲苯用量及渗透处理时间对细胞酶活力的影响差别很小，最终确定了以2%的甲苯为渗透剂制备通透性细胞海藻糖合成酶的工艺路线，渗透处理30min后，海藻糖合酶的表观酶活增加缓慢，若以渗透处理120min时海藻糖合酶的表观酶活为100%，渗透处理30min所得酶活即可达95%左右[12]。

薛璐等在由恶臭假单胞杆菌获取透性化细胞海藻糖合酶的基础上研究此酶酶学特性的实验中，采用甲苯和EDTA对恶臭假单胞杆菌H76菌株进行了渗透处理，所得通透性细胞海藻糖合酶酶活高出未处理细胞的100倍以上 [13，14] 。

4、总结