不同碳源下Streptomces albulus PD-1 产聚赖氨酸的研究

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简称ε-PL）是日本的酒井平一和岛昭二两位博士1977年在大量筛选有价值的生物碱（Dragendorff-positive）物质时首次发现的一种新型聚合物[1]。ε-PL是现在自然界仅发现的四种氨基酸同聚物之一，其具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，且具有安全性能高、水溶性好、热稳定性好等优点，是一种性能优良的生物防腐剂。目前，日本、韩国、美国等国家已经批准其作为食品防腐剂进行应用。同时鉴于其聚阳离子性，水溶性好，热稳定性好，生物可降解等显著特点，ε-PL及其衍生物具有广阔的应用前景，除了食品防腐剂还被利用在食疗剂、生物可降解纤维、乳化剂、高吸水性凝胶、抗癌增效剂、药物载体及生物芯片包衣等行业。此外，ε-PL在化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料等领域也具有广阔的开发和应用前景[2]。相对于其巨大的市场需求，但目前世界上仅有日本实现了ε-PL工业化，ε-PL的生产还不能满足市场的需求，导致ε-PL市场价格居高不下，限制它的广泛应用。同时我国对于ε-PL研究也逐步从实验室阶段向工业化生产过渡。总之，ε-PL作为一种具有巨大的应用潜力与商业价值的生物高分子，已成为众多学者的研究热点。

日前工业上一般采用S.albulus作为ε-PL的发酵生产菌株，它是1981年由Shima S和Sakai H筛选得到并进行分类鉴定的。ε-PL发酵生产的影响因素很多，包括菌株、培养基、培养条件等均与ε-PL的生产密切相关，各国学者也对ε-PL的生产条件进行了深入的探究。1998年，日本学者通过筛选赖氨酸的结构类似物(S)-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(S-AEC)的抗性菌株来遗传性地解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制,进而积累赖氨酸,再由聚赖氨酸聚合酶聚合,从而达到高产ε-PL的目的[3]。2006年台湾学者将S.albulus IFO14147在发酵罐中进行批次补料发酵聚赖氨酸，通过控制两阶段的pH值和葡萄糖供给的控制产出高产量的ε-PL。第一阶段保持pH值为6.8培养48h，从而得到稳定的高密度细胞；第二阶段保持pH值为4.0，且当葡萄糖消耗后就不断添加以维持葡萄糖浓度为10g/L,从而增加了ε-PL的积累, 同时也证明pH值的控制和葡萄糖的供给是增加聚赖氨酸的产量必不可少的[4]。Guoliang Wang等发现亚铁离子能够影响Streptomyces diastatochromogenes CGMCC3145合成ε-PL。亚铁离子能够对代谢途径中主要的酶活和ε-PL生产中底物的消耗产生影响。当Streptomyces diastatochromogenes CGMCC3145中加入0.1mm亚铁离子培养72h，能够发现ε-PL的产量和菌体量分别增加29.2％和41.9％，同时消耗的葡萄糖的量、氨氮的含量和磷的含量也分别增加50％、67.6％和35.7％。而且通过酶活显示出蛋白酶、磷酸酶、谷氨酸脱氢酶以及天冬氨酸转氨酶的活性都有所增加。所以添加亚铁离子能够通过提高天冬氨酸盐产物进一步催化产生更多供ε-PL合成的赖氨酸前提，从而提高ε-PL的产量[5]。张扬等通过固定化的方法，通过丝瓜瓤固定Kitasatospora sp. MY 5-36的菌丝体，从而使得单位体积的菌丝体量提升，最终ε-PL的发酵液中含量达到了34.11g/L，同时利用固定在丝瓜瓤上的菌丝体作为下一批次发酵的种子进行重复批次发酵大大提高了发酵的效率，节约了发酵时间和成本[6]。Jun Xia等人从S. albulus PD-1生产ε-PL的发酵液中纯化得到聚二氨基丙酸（PDAP），PDAP是一种新颖的非蛋白氨基酸低聚物，并且能够很好的抑制酵母的活力。同时Jun Xia等人发现在S. albulus PD-1发酵时，向培养基中添加柠檬酸培养时能够抑制PDAP的产生，从而增加ε-PL的产量[7]。总之通过对菌种的筛选、诱变以及发酵条件的优化，现在ε-PL的生产水平已经有了很大程度的提高。但是这些实验大部分都集中在一些外部条件的改变，而对发酵过程中菌体内部的一些代谢途径的变化很少涉及。

微生物在生长、繁殖和代谢过程中需要碳源和氮源作为营养物质，还需要一些微量元素作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物质。碳素化合物是构成菌体成分的重要元素，是微生物生长的碳架和能量来源，是产生各种代谢产物的重要原料，同时也是供给微生物维持生命活动所需能量的主要能源。在ε-PL的工业生产中一般使用葡萄糖为碳源，江南大学陈旭升等根据Streptomyces sp.M-Z18能利用甘油作为碳源这一特性，提出了工业甘油、甘油和葡萄糖混合物、前体L-赖氨酸作为发酵底物的供给策略，通过发酵工程优化与调控技术，显著提高了ε-PL发酵水平，最终使ε-PL的产量达到35.6g/L，此外，使用甘油作为碳源不仅降低了发酵成本，也是化工行业的副产物-甘油得到了利用[8,9]。Shoji Shima等人研究了小白链霉菌strain No.346对于不同碳源的研究，发现其能利用葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇而不能利用蔗糖、阿拉伯糖、木糖、水养苷、棉籽糖[10]。伴随着S. albulus PD-1完成了全基因组测序，并且以此建立了S. albulus PD-1的完整的代谢网络，使得我们能够对S. albulus PD-1体内的整体代谢情况有个相对清晰的了解。本实验详细研究S. albulus PD-1 对于不同碳源的利用情况，挑选葡萄糖、甘油、蔗糖、D-果糖、可溶性淀粉、D-甘露醇、阿拉伯糖、棉籽糖、鼠李糖9种碳源作为研究对象。分别研究S. albulus PD-1 在不同碳源下的菌体生长情况，菌丝体形态，ε-PL、PDAP产生情况，辅因子（NADH/NAD、NADPH/NADP）以及ATP的水平，体内关键代谢节点基因的转录水平以及酶活的变化。希望通过S. albulus PD-1 在不同碳源下发酵行为的研究，对其生理生化有进一步了解，并希望以此筛选出新型的廉价碳源。

参考文献：

[1]. Shima S, Sakai H. 1977. Polylysine produced by Streptomyces. Agric. Biol. Chem. 41: 1807-1809.

[2]Yoshida, T., Nagasawa, T., 2003. ε-Poly-L-lysine: microbial production, biodegradation and application potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 21#8211;26.

[3]. Hiraki J, Hatakeyama M, Morita H, et al. Improved curly epsilon-Poly-L-Lysine Production of an S-(2-Aminoethyl)-L-Cysteine Resistant Mutant of Streptomyces albulus[J]. Seibutsu Kogaku Kaishi, 1998, 76: 487-493.

[4]. Kahar P, Iwata T, Hiraki J, et al. Enhancement of ε-polylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control. Journal of bioscience and bioengineering, 2001, 91(2): 190-194.

[5]. Guoliang Wang，Shiru Jia ，Tian Wang，Liye Chen， Qingchao Song， Weina Li. Effect of Ferrous Ion on e-Poly-L-Lysine Biosynthesis by Streptomyces diastatochromogenes CGMCC3145. Curr Microbiol (2011) 62:1062#8211;1067