1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

课题背景：

随着人们对健康问题和食品安全的要求愈来愈高，特别是最近几年食品防腐剂产生的一系列健康问题使人们将目光转向了生物防腐剂的开发上。近年来将Nisin、香辛料提取物、大蒜提取物、溶菌酶、茶多酚等天然保鲜剂应用于冷鲜肉保鲜以及其它食品中取得了一定的效果，这其中ε-聚赖氨酸(以下简称ε-PL)作为一种光谱的抑菌剂成为了生物防腐剂的一颗明星。 ε-PL是一种新型生物防腐剂，1977年日本Shima等^[5]人首先在白色链霉菌的培养液中发现这种化合物，ε-PL是一种由25~45个赖氨酸残基通过ε-氨基和α-羧基连接而成的同聚物。ε-PL作为防腐剂具有抗菌效力强、安全性高、水溶性好、适用pH广及在高温条件下具有稳定性等特点^[6-8]。它能够抑制包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌以及病毒在内的多种微生物的生长繁殖^[9-14]。具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，且具有安全性能高、水溶性好、热稳定性好等优点，是一种性能优良的生物防腐剂。此外它还能够抑制小肠中脂肪酶活性，进而抑制小肠对脂肪的吸收，因此它可以作为抗肥胖剂^[15-18]。此外，ε-PL在化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料等领域也具有广阔的开发和应用前景。目前ε-PL在日本已经工业化，并在包括日本、韩国、美国在内的多个国家得到广泛应用^{[6, 12,19]}，我国多家研究机构和生产部门也已经完成中试生产。 ε-PL具有水溶性、聚阳离子、无毒可食用、可生物降解等许多独特的理化和生物学特性，这些特性使其具有抗菌抗病毒、安全、耐高温等优点。因此，在注重安全、环保的今天，ε-PL及其衍生物在食品、医药、农业、电子等诸多领域将具有十分广阔的应用前景（表3-2）。 表3-2 ε-PL及其衍生物的应用

4．ε-PL发酵生产的主要影响因素

ε-PL发酵生产的影响因素很多，包括菌株、培养基、培养条件等，均与ε-PL的生产密切相关。 自然界筛选得到的ε-PL生产菌株其产量普遍很低（摇瓶产量低于2 g L^-1），所以具有实际生产价值并能够用于工业生产的菌株均经过诱变选育得到。1988年チッソ株式会社的平木纯和森田裕以S. albulus 346菌株为出发菌株，经过N-甲基-N-硝基-N^#8217;-硝基胍 （N-methyl-N-nitro-N^#8217;-nitrosoguanidine，NTG）作用后，以L-赖氨酸的结构类似物S-AEC为筛选标记，筛选得到编号为11011A-1号的突变菌株，其摇瓶发酵产量比出发菌株提高3.3倍；此外还以100 mg L^-1的氯霉素作用于S. albulus 346菌株并培养8 h，筛选得到质粒扩大菌株编号为50833菌株，其摇瓶发酵产量比出发菌株提高9倍^[14]。1997年チッソ株式会社的岩田敏治和平木纯等^[15]以S. albulus 11011A-1为出发菌株，经过NTG、紫外线照射、5-溴尿嘧啶等试剂处理后，以10 mg mL^-1的S-AEC作为抗性标记，筛选得到编号为B21021的S-AEC高浓度抗性菌株。2001年Kahar等^[17]以S-AEC和Gly为抗性标记，以S. albulus 346菌株为出发菌株，筛选得到具有AEC^r和Gly^r的菌株编号为S. albulus 410，其摇瓶产量提高6倍。 ε-PL的生产菌株培养基与培养条件较为苛刻，ε-PL培养基一般采用半合成培养基，需要添加有机氮源，如酵母膏、牛肉膏等，此外，碳源，如葡萄糖，无机氮源，如硫酸铵，金属离子如Mg² 、Zn² 、Fe² 等也都是必需的。此外，ε-PL生产过程中pH也是极为关键的，较高的pH容易使菌株中的ε-聚赖氨酸降解酶发生作用，使ε-PL发生降解（见本章第二节）。 ε-PL生产工艺优化对于ε-PL的影响也很大。由于ε-PL产生菌株的摇瓶批式发酵产量低下，均在0.2~10 g L^-1。为此，平木纯等人采用发酵罐批式发酵，并采用调控pH等条件来提高ε-PL产率。1997年，チッソ株式会社的岩田敏治和平木纯等^[15]以B21021菌株为研究对象，3 L发酵罐中采用10%氨水调控体系pH4.0，补加葡萄糖和硫酸铵，发酵培养72 h时ε-PL产率为16.2 g L^-1，而发酵培养168 h时ε-PL产率为31 g L^-1，产率有了较大幅度的提高。2001年Kahar 等人研究了S. albulus 410菌株在5 L发酵罐中调控发酵，结果发现在搅拌转速为350 r min^-1，通气量为1 vvm下，采用氨水调控体系pH值，在发酵前期调控体系pH5.0，以促进菌体增长；在发酵中后期调控体系pH4.0，补加葡萄糖和硫酸铵，在补加葡萄糖时，葡萄糖浓度控制在10 g L^-1左右，发酵培养8天后，ε-PL产率高达48.3 g L^-1，较没有采取调控时，产率提高10倍之多^[17]。此外，由于白色链霉菌在发酵过程中形成菌丝球，搅拌转速的提高，产生巨大的剪切力，容易将菌丝球剪切成丝状，增加了细胞内核苷酸等相关物质渗入到发酵液中，不利于产物的提取，并且提高搅拌转速，需要消耗大量的动力，增加了工业化成本。2002年Kahar等^[18]采用气升式发酵罐生产ε-PL，在动力消耗为0.3 kw m^-3下，ε-PL产率可达30 g L^-1，而在搅拌罐中生产相同产量的ε-PL则需要消耗8 kw m^-3，由此表明，采用气升式发酵罐生产ε-PL可以更有效地降低生产成本。 目前世界上仅有日本实现了ε-PL工业化^[2]，ε-PL市场价格居高不下，限制它的广泛应用。总之，ε-PL作为一种具有巨大的应用潜力与商业价值的生物高分子，已成为众多学者的研究热点。 根据现在的研究表明，PH是影响聚赖氨酸发酵的一个重要的因素，现在一般的工业化生产都是使用PH4.0的条件，尚无其他PH条件下聚赖氨酸发酵的报道，我们希望研究下不同PH下的小白链霉菌的生长和发酵情况，来更好的理解聚赖氨酸的发酵过程。文献报道^[23]，pH值对ε-PL的产率影响很大，跟菌体细胞膜结构中并存着PLS和PLD。S. albulus发酵过程中，当pH为5.0~7.0时，ε-PL不会积累，因为这时PLD的活力远高于ε-PL合成酶的活力，合成的ε-PL很快会被降解；而当pH为4.0~4.2时，PLD的活力下降，但PLS的活力却很高，因此这时菌体会大量合成ε-PL而很少会被降解掉。当pH继续下降，合成酶的活力会随之下降，当pH为3.0时，PLS基本已没有活力。本课题准备就pH对小白链霉菌发酵产生ε-PL做系统的研究。

课题内容：

本课题组以徐虹教授课题组为主要依托，在5L发酵罐中对S. albulus PD-1进行不同PH下的发酵，需测PH3.5、4.0、4.5、5.0、6.0以及不控制PH共6批次下ε-PL的产量、小白链霉菌的生长情况以及耗糖、溶氧等数据，以此比较全面的了解小白链霉菌在不同PH下的发酵情况，为以后的代谢调控及工业化生产打下基础。

参考文献

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4 Shima S，Sakai H．Poly-L-lysine produced by Streptomyces．Part Ⅲ．Chemical studies．Agric．Biol．Chem．，1981，45(11)：2503~2508

5 广原日出男，竹原宗范，相原丰．低分子ε-ポリ-L-リジンを生产すゐ菌株及びそれを用いた低分量ε-ポリ-L-リジンの制造法．日本．JP200117159A．2001．1．25

6 广原日出男，竹原宗范．低分子量ε-ポリ-L-リジンを生产すゐ菌株及びそれを用いた低分子ε-ポリ-L-リジンの制造法．日本．JP200295466A．2002．4．2

7 广原日出男，竹原宗范．低、中重合度ε-ポリ-L-リジンを生产すゐ菌株及びそれを用いた低、中重合度ε-ポリ-L-リジンの制造法．日本．JP200295467A．2002．4．2

8 广原日出男．低重合度ε-ポリ-L-リジンを生产すゐ菌株及びそれを用いた低重合度ε-ポリ-L-リジンの制造法．日本．JP200352358A．2003．2．25

9 Ouyang J，Xu H，Li S，et al．Production of epsilon-poly-L-lysine by newly isolated Kitasatospora sp．PL6-3．J．Biotechnol．，2006，1：1459~1463

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16 广原日出男，竹原宗范．ε-ポリ-L-リジンを生产すゐ菌株及ぴそれを用ぃたε-ポリ-L-リジンの制造法．日本．JP200069988A.．2000．3．7

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18 Kahar P，Kobayashi K，Iwata T，et al．Production of ε-polylysine in an airlift bioreactor (ABR) ．J．Biosci．Bioeng．，2002，93(3)：274~280

19 Takahiro K，Takaaki K，Ju H，et al．Biosynthesis of ε-poly-L-lysine in a cell-free system of Streptomyces albulus．Biochem．BiophyRes．Commun．，2003，311： 635~640

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24 Xiaohai F，Hong X，Xiaoyin Xu，et al．Purification and some properties of ε- poly-L-lysine-degrading enzyme from Kitasatospora sp. CCTCC M205012．Process Biochem．，2008，43：667~672

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题组以徐虹教授课题组为主要依托，在5L发酵罐中对S. albulus PD-1进行不同PH下的发酵，需测PH3.5、4.0、4.5、5.0、6.0以及不控制PH共6批次下ε-PL的产量、小白链霉菌的生长情况以及耗糖、溶氧等数据，以此比较全面的了解小白链霉菌在不同PH下的发酵情况，为以后的代谢调控及工业化生产打下基础。