1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1.1南京盐水鸭

南京盐水鸭属中国传统特色酱卤肉制品，具有颜色洁白、肉质细嫩、口感滑润、风味独特的特点，主要经过干腌、复卤（湿腌）、烘干、煮制、冷却、包装等工艺加工而成，”熟盐搓、老卤复、吹得干、煮得足”形象地说明了各加工单元的方法要求[1]。南京盐水鸭是一个地方品牌，有几十个品种，且食用品质特征各不相同，良莠不齐；与传统盐水鸭的标准正宗特征：”皮白、肉鲜、香、嫩、咸淡适中、清淡爽口”有一定差距。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1主要研究内容

（1）鱼肉提取物（蛋白酶粗酶）的提取与活性测定

（2）鱼肉提取物对盐水鸭嫩度的影响

（3）鱼肉提取物对盐水鸭出品率的影响

（4）鱼肉提取物对盐水鸭含水率的影响

（5）鱼肉提取物对盐水鸭保水性的影响

（6）鱼肉提取物对盐水鸭肉质色差的影响

（7）鱼肉提取物对盐水鸭感官品质的影响

2.2实验方法

2.2.1蛋白酶的提取与纯化

（1）实验准备NaCl、CaCl2、 Triton-X100、蔗糖、Tris-HCl 、PMSF

1）0.9％NaCl盐水

2）Homogenization buffer A：（10mM CaCl2#183;2H2O，0.25％V/V Triton-X100，25mM 蔗糖，pH7.4）（1.11g无水CaCl2、8.33mL30％的Triton-X100、8.55g蔗糖）（30%Triton-X100由28.2mL Triton－100，72.8mL 50mM TBS, pH7.4）

3）Resuspension buffer B ：（50mM Tris-HCl，0.1 M CaCl2#183;2H2O，0.15M NaCl，1mM PMSF）（6.1252g 的三羟甲基氨基甲烷、1.11 g无水CaCl2、8.775g NaCl与约800mL蒸馏水溶解，与适当盐酸混合，调节pH7.4左右，加水定容至1000mL）

4）Resuspension buffer C：(25mM Tris HCl, 10mM CaCl2 2H2O,.0.2 M NaCl,.0.05%Brij-35,1mM PMSF, pH7.4, 4#176;C) （3.0626g 三羟甲基氨基甲烷、1.11g 无水CaCl2、11.7467g NaCl与约800mL蒸馏水溶解，与适当盐酸混合，调剂pH7.4左右，加水定容至1000mL）

（2）操作步骤

1）将鲜活鲫鱼（~500g）击晕后剖腹清除内脏，洗净。取鱼背部肉作为实验原料，剔除红肌，于-18℃放置约15min，待温度降至4℃左右待用。

2）将鱼肉切丁，按1:1（m/v）浸于4℃，0.9％NaCl盐水中；可有效去除血水

3）将鱼肉样品以1:6.6（m/v）与Homogenization buffer：（10mM CaCl2#183;2H2O，0.25％V/V Triton-X100，25mM 蔗糖，pH7.4），均质处理45s，中间间隔15s。在4℃搅拌提取30min，然后进行离心分离6000g#215;20min，4℃。7400rpm/min GL-20G-Ⅱ上海安亭离心机RCF=1.118*10-5*N2*R(g)，其中R为9.8cm

4）去除上清，收集沉淀，以1:3（m/v）溶于Resuspension buffer（最好均质处理5～10s，但不能剧烈到起泡），4℃缓慢搅拌1小时后，分装于50mL的试管中（每管中装20mL）。

5）把试管放入60℃水浴锅中加热，至管内温度达到60℃（约需14min，约），维持1min。

6）取出试管放入冰水浴中，搅拌使其温度降低至4℃，离心（20 min，10000g， 4℃），收集上清液。9600rpm/min

7）将上清液中（4℃）加入(NH4)2SO4至饱和度为20％（113g/L），离心（40 min， 3000g， 4℃）5300rpm/min，弃去沉淀（几乎没有沉淀），收集上清液再用饱和度为70％(NH4)2SO4（337g/L）的沉淀，（20min， 10000g， 4℃）后收集沉淀。9600rpm/min

8）将上述沉淀以1:1（m/v）溶解于悬浮缓冲液c（3.0626g三羟甲基氨基甲烷、1.11 g无水CaCl2、11.7467gNaCl与约800mL蒸馏水溶解，与适当盐酸混合，调剂pH7.4左右，加水定容至1000mL）中，缓慢搅拌均匀后离心（30 min， 7500g， 4℃）8300rpm/min，上清液即为胶原酶粗酶（CE），透析24h 0~4℃低温保存。

9）Sephadex G-100装柱后，用3V凝胶缓冲液4℃平衡(10 mM Tris HCl,10mM CaCl22H2O,.0.2MNaCl,0.05%Brij-35,0.02%NaN3,pH7.4)流速为30mL/min，280nm检测，每隔5mL收集。

2.2.2考马斯亮蓝G-250染色法测定MMPs的含量

（1）实验准备

1）染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。

2）标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。

3）未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10#8212;30mg/ml

（2）操作步骤

标准曲线的制作

1）取7支试管，按下表加入试剂

2）将试管摇匀，放置20分钟。

3）用分光光度计比色测定吸光值A595nm。

4）以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品的测定

1）取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.

2）将试管摇匀，放置20分钟。

3）比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。

2.2.3剪切力的测量

取室温下（约20℃）的鸭肉样品，胸肉按肌纤维方向切成约40mm*10mm*10mm的长条（肌纤维走向与40mm边长方向平行），腿肉按肌外膜自然剥离成5块，厚度约1cm，立即置于质构仪上进行检测，选择TMS VOLODKOVITCH BITE JAWS 咬断力检测探头，进行质构测定。测定条件设置如下：探头测量模式为阻力测试(Measure Force in Compression)；探头运行方式为循环方式；探头下行速度为5.0mm/s，探头返回速度为5.0mm/s，测试高度为20mm，测试前速度为0.5mm/s。

运行程序如下：

(1) MESSAGE”校正感应源”#8212;#8212;(2) ZERO value of load and displacement#8212;#8212;(3) MESSAGE”设定零点”#8212;#8212;(4) RUN @30.00mm/min until load=1.000kgf#8212;#8212;(5) ZERO value of displacement#8212;#8212;(6) MESSAGE”设定工作参数”#8212;#8212;(7) ENTER @”测试高度#8217;，displacement value (mm) for V0#8212;#8212;(8) ENTER @”测试前速度#8217;，speed value (mm/sec) for V1#8212;#8212;(9) ENTER @”测试速度#8217;，speed value (mm/sec) for V2#8212;#8212;(10) ENTER @”返回速度#8217;，speed value (mm/sec) for V3#8212;#8212;(11) CLEAR MESSAGE#8212;#8212;(12) PAUSE for ? sec,audio disabled#8212;#8212;(13) CLEAR MESSAGE#8212;#8212;(14) RUN @ ～300.00 mm/min until displacement =～V0mm#8212;#8212;(15) MESSAGE ”准备好样品，按开始”#8212;#8212;(16) PAUSE for ? sec,audio disabled#8212;#8212;(17) CLEAR MESSAGE#8212;#8212;(18) RUN @V1 mm/min until load=0.200kgf#8212;#8212;(19) CLEAR DATA#8212;#8212;(20) CLEAR GRAPH#8212;#8212;(21) RUN @V2 mm/min until displacement=～5.00mm#8212;#8212;(22) RUN @～V3 mm/min until displacement=～V0mm#8212;#8212;(23) PAUSE for 1.000sec,audio disabled#8212;#8212;(24) RUN @V2 mm/min until displacement=～1.00mm#8212;#8212;(25) RUN @～V3 mm/min until displacement=～V0mm#8212;#8212;(26) END

2.2.4 含水率的测定

取直径为9cm的滤纸放入数显鼓风干燥箱中烘至恒重。将新鲜肉样切分成边长约为5mm的正方体肉丁，用感量为0.1mg的分析天平称取约2g肉样，用已烘至恒重的滤纸包好，放入数显鼓风干燥箱中，温度为105℃，至恒重。计算公式为：

X=1-(m2-m0)*100%/(m1-m0)#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;（2.2.4）

式中：

X#8212;#8212;含水率(%)；

m0#8212;#8212;滤纸的质量(g)；

m1#8212;#8212;肉样和滤纸的质量(g)；

m2#8212;#8212;恒重时滤纸与肉样的总质量(g)。

计算结果保留4位有效数字。

2.2.5系水力的测定

将新鲜肉样切分成边长约为5mm的正方体肉丁，用感量为0.1mg的分析天平称取约10g肉样，用纱布包裹，再用十八层以上的吸水纸包裹。使用应变控制式无侧限压力仪以35kg力连续施压5min后测定肌肉的系水力。计算公式为:

X1=1-(m0-m1)/(m0*X)#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230; （2.2.5）

式中：

X1#8212;#8212;系水力；

m0#8212;#8212;加压前的质量(g)；

m1#8212;#8212;加压后的质量(g)。

X#8212;#8212;含水率(%)；

计算结果保留4位有效数字。

2.2.6 L、a、b值的测量

根据光学原理，用色差仪进行测定。CIEL*a*b*是常用的肉色系统，L*称为明度系数，L*=0表示黑色，L*=100表示白色。a*为红度值，值为正时表示红色，负时表示绿色。b*为黄度值，值为正时表示黄色，负时表示蓝色。a*、b*值决定色调。

将样品切成边长约2mm的小块，用吸水纸吸去表面水分后，色差仪校零后，测定样品的亮值(L) 、红值(a) 、黄值(b) 。

2.2.7鸭肉出品率的测定

根据不同的煮制方式对鸭肉进行出品率的测定，对整个鸭子在煮制的前后进行称重，之后做比较，从而确定鸭肉的出品率。计算公式为：

X=(m2-m0)*100%/(m1-m0)#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;#8230;（2.2.7）

式中：

X#8212;#8212;出品率(%)；

m0#8212;#8212;垫纸的质量(g)；

m1#8212;#8212;生鸭和垫纸的质量(g)；

m2#8212;#8212;成品鸭肉时垫纸与肉样的总质量(g)。

计算结果保留4位有效数字。

2.2.8感官评价测定

感官评价标准

由11位感官评定的人员组成评定小组，根据色泽（15%）、形态（15%）、组织结构（25%）、口感（25%）、风味（25%）对其进行综合评分，有差距的酌情扣分评分标准如表2-4所示

表2-2-8感官评定标准