摘 要

D-阿洛酮糖是d-果糖C3差向异构体，又被称为d-阿卢糖或者d-核糖-2-己酮糖，国际稀有糖协会（ISIR）认为它很少见。蔗糖比D-阿洛酮糖甜30%，但是D-阿洛酮糖提供的热量仅是蔗糖的3%，因此拿他当做蔗糖最好最合适的替代品被使用。它有重要的生理功能，如血糖抑制，活性氧清除活性和神经保护作用。而且，它可以改善胶凝行为并在食品加工过程中产生良好的味道。重要的是，在2012年6月，它被食品和药物管理局（FDA）授予“公认的安全”（GRAS）标志（GRN第400号），并被批准为一系列食品和饮食的组成部分。D-果糖的商业生物生产可以通过使用d-塔格糖3-差向异构酶（DTE）酶家族的d-果糖差向异构化来实现。由于其在稀有糖生物生产中的重要性，它已引起许多研究者的关注。最近，已经鉴定和表征了来自多种微生物的不同DTE基因。2006年，有人鉴定出了第二种在酮己糖中能够表达C-3差向异构酶活性的酶，是从根癌农杆菌中鉴定出的，并将其命名为d-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）。有文献说明，D-果糖可以通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化的化学反应将其转化成相反的构型，从而生成D-阿洛酮糖。同时，它对d-阿洛酮糖还具有一定的高底物特异性。新发现的DPE吸引了巨大的商业利益，并将在未来广泛用于生产稀有糖。然而，在大多数研究中，DPE在革兰氏阴性细菌中过表达，大肠杆菌和重组大肠杆菌不适用于食品工业中使用的产品的生产。此外，DPE是在大肠杆菌的细胞内过表达的，这使得蛋白质分离和纯化过程变得复杂。

我们的课题首先需要通过重组的方式去构建菌株PET28a-DPE作实验所需。诱导后，通过离心获得反应所需的粗酶溶液，并将其加入到一定浓度的果糖溶液中，在酶的最适温度下进行催化反应。反应完成后，通过加热和煮沸使酶失活以过滤酶，然后将酵母加入溶液中以除去大部分果糖，然后使用Ca2 型阳离子交换树脂除去酶，剩余的果糖溶液和溶液中含有的酸。通过这种方式纯化并浓缩结晶D-阿洛酮糖，得到所需的D-阿洛酮糖晶体。

关键词：D-阿洛酮糖 D-阿洛酮糖3-差向异构酶 生物催化 纯化结晶

Biological preparation of D-psicose

Abstract

D-psicose is the d-fructose C3 epimer, also known as d-alulose or d-ribose-2-hexulose, which is defined by the International Rare Sugar Association (ISIR) as a rare sugar. . The sweetness of D-psicose is 70% of the sweetness of sucrose, but the energy of D-psicose is only 3% of sucrose, so it can be used as the best and most suitable substitute for sucrose. It has important physiological functions such as glycemic control, active oxygen scavenging activity and neuroprotection. In addition, it improves the gelling behavior and can produce a good taste during food processing. Importantly, in June 2012, It has been awarded the Generally Recognized As Safe（GRAS）Mark (GRN No. 400). Supplements. Commercial bioproduction of D-psicose can be achieved by d-fructose epimerization using the d-tagatose 3-epimerase (DTE) family of enzymes. Because of its importance in the production of rare sugar bio-productions, it has attracted much more attention of many University teachers. Recently, we already identity and representative many different D T E genes from many microorganisms. In 2006, a second enzyme with C-3 epimerase activity in ketohexose was identified from Agrobacterium tumefaciens, named d-psicose 3-epimerase (DPE).It has been reported that D-psicose 3-epimerase (EC 5.1.3.30) has high substrate specificity for d-psicose and can effectively catalyze d-fructose epimerization. To produce d-psicose. The newly discovered DPE attracts huge commercial benefits and will be widely used in the production of rare sugars in the future. E. coli and recombinant E. coli are not suitable for the production and development of food-grade products.. In addition, DPE overexpression is intracellular in E. coli, which makes the protein separation and purification process sophisticated.

This subject firstly constructs the recombinant strain PET28a-DPE required for the experiment. After induction, the crude enzyme solution required for the reaction is obtained by centrifugation, and it is added to a certain concentration of fructose solution, and the enzyme is carried out under the optimum temperature of the enzyme. Catalytic reaction. After the reaction is completed, the enzyme is inactivated by heating and boiling to filter out the enzyme, and then the yeast is added to the solution to remove most of the fructose, and then the Ca2 -type cation exchange resin is used to remove the remaining fructose solution and the solution contained in the solution. This acid is an essential product in the process of obtaining D-psicose by an experimental method. We purify D-psicose by removing the acid from the solution and then crystallizing it.

KEYWORDS: D-allulose D-psicose3-epimerase Bio catalysis Purification crystallization

目 录

摘 要 I

Abstract III

第一章 文献综述 1

1.1 D-阿洛酮糖的相关信息 1

1.1.1 D-阿洛酮糖的实验意义 1

1.1.2 关于D-阿洛酮糖 1

1.1.3 D-阿洛酮糖特性 2

1.1.3.1危害程度 2

1.1.3.2 使用效果 3

(1) 控制血糖作用 3

(2) 改善身体状况 3

1.1.4 D-阿洛酮糖未来前景 3

1.2.D-阿洛酮糖 3-差向异构酶 4

1.2.1 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的微生物来源 4

1.2.2 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的性质 4

第二章 材料和方法 6

2.1 前言 6

2.2 材料与方法 6

2.2.1 材料 6

1.菌株 6

2.培养基 6

3.主要试剂 6

4.主要仪器 7

2.2.2实验过程 7

1.重组大肠杆菌的构建 7

2.质粒转化入DH5α扩增 7

3.养菌 8

4.提质粒PET28a-DPE 8

5.将PET28a-DPE质粒转化入BL21 8

6.粗酶液制备，OD600的测定及液相色谱检测 9

7.跑蛋白胶验证PCR后的产物是否为实验所需 9

8.催化反应 9

9.纯化结晶D-阿洛酮糖 10

第三章 实验结果与分析 12

3.1 反应条件研究 12

3.2 D－阿洛酮糖的反应成品率 12

3.3 D－阿洛酮糖阳离子交换柱除酸条件 13

3.3.1 温度对反应的作用 13

3.3.2 填料体积对反应的作用 14

3.3.3 进样对反应的作用 14

3.4 分离方法研究 16

第四章 结论与展望 17

4.1结论 17

4.2展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 D-阿洛酮糖的相关信息

1.1.1 D-阿洛酮糖的实验意义

甜味剂是食品添加剂工业和动物饲料工业中必不可少的重要产品，并且在世界范围内被广泛用作添加剂，传统的甜味剂如蔗糖，白糖等通常是人体高热量，高吸收性的甜味剂，并且是导致肥胖，糖尿病，心血管疾病，龋齿等的重要因素[1]。国际糖业协会（ISRS）准确地将稀有糖定义为一类在自然界中发现但含量特别低的单糖和衍生物,D-阿洛酮糖是一种天然存在的极其罕见的稀有糖，具有高甜度，溶解性好，热量低和降血糖的作用[2]。添加入食物中可以改善食物的凝胶化，它还可以与食物蛋白质反应，以改善食物的气味。在吃的里面加入D-阿洛酮糖可有效降低餐后血糖反应，大大提高胰岛素敏感性和糖耐量;在医疗保健方面，D-阿洛酮糖可以通过抑制脂肪酶和α-糖苷酶的活性，从而减少体内脂肪的积累，同时抑制血糖浓度的增加[5]。当它被人体食用后，不易被人体代谢，可以说它不产生能量，没有腐蚀作用，并且具有良好的食品加工特性,作为一种新的功能性甜味剂成分，它基本上已经可以替代我们传统的食品甜味剂，并且已成为功能性食品添加剂研究领域的热门[6]。其次，D-阿洛酮糖还可以有效地清除活性氧物质，并且在神经退行性疾病和动脉粥样硬化的治疗中具有潜在的作用。

为了进一步研究D-阿洛酮糖的性质并促进其在食品领域的应用，获得大量价格合理且纯度高的D-阿洛酮糖尤为重要,D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，它是单糖[7]。已经发现D-果糖可以用作来自D-塔格糖-3-差异A异构酶家族的反应底物，其使用生物酶来催化D-精神病的大量生产，但产物是D-异黄酮。 糖和D-果糖的混合物，D-果糖的含量非常高，因此我们研究了D- alloxone和D-果糖的分离技术，这对生物学方法对D-精神病的产业化具有指导意义。由于Pb2 型阳离子交换柱的毒性很高，所以我们优选Ca2 型阳离子交换树脂来做我们的食品级分离研究。

1.1.2 关于D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖(D-psicose/D-allulose)又称为D-核糖-2-己酮糖，是一种在自然界中发现的稀有糖，但是很罕见[6]。D-阿洛酮糖具有C-3位与果糖相反的构型，他的结构式见下图1。D-阿洛酮糖的甜度相当于蔗糖甜度的70%，却它仅提供蔗糖卡路里的约0.3％，还有与蔗糖类似的味道和体积特征，而且与蔗糖一样能和食物中的氨基酸及蛋白质发生美拉德反应[8]，是蔗糖最好最合适的代替物，被称为“低能量热量蔗糖”。

以上是毕业论文大纲或资料介绍，该课题完整毕业论文、开题报告、任务书、程序设计、图纸设计等资料请添加微信获取，微信号：bysjorg。

相关图片展示：