摘要：威兰胶可由革兰氏阴性菌Sphingomonas sp.好氧发酵生产，随着威兰胶的积累，发酵液粘度迅速增大，严重制约了氧传递效率，使得溶氧成为威兰胶生产效率提高的重要限制因素。透明颤菌血红蛋白（vitreoscilla hemoglobin，VHb）是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白，该蛋白能使透明颤菌在低氧条件下生存并保持较高的生长速率，近年来在生物工程领域的应用越来越广泛。本课题拟利用基因工程技术从透明颤菌（vitreoscilla）中扩增出透明颤菌血红蛋白（vitreoscilla hemoglobin，VHb）基因（vgb）片段，并将其在鞘氨醇单胞菌中异源表达，以期提高菌体对低溶氧条件的耐受性，达到提高威兰胶产量的目的。

关键词：威兰胶 透明颤菌血红蛋白基因 发酵

威兰胶（welan gum）是分子量多达数百万的微生物多糖，该多糖易溶于水，其水溶液具有独特的流变学性质和良好的耐高温、耐酸碱性。作为悬浮剂、增稠剂、稳定剂等广泛应用于水泥、石油、食品、石墨等行业^[1,2]。威兰胶可由革兰氏阴性菌Sphingomonas sp.好氧发酵生产，随着威兰胶的积累，发酵液粘度迅速增大，严重制约了氧传递效率，使得溶氧成为威兰胶生产效率提高的重要限制因素。目前提高氧传递速率的方法主要集中在增加搅拌速率或者通气量，然而高强度的剪切力会导致细胞破裂，同时控制泡沫的形成也提高威兰胶生产的经济成本。

透明颤菌血红蛋白（vitreoscilla hemoglobin，VHb）是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白，该蛋白能使透明颤菌在低氧条件下生存并保持较高的生长速率，近年来在生物工程领域的应用越来越广泛^[3]。目前已有将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）转化入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等的报道，菌体在低氧条件下的生长速率以及次级代谢产物的产量均有所提高^[4]。然而，并没有透明颤菌血红蛋白基因应用在威兰胶中的报道。

1. 威兰胶的结构及性质

威兰胶是由某些产碱杆菌 Alcaligenes sp. 合成的微生物杂多糖，分子量高达数百万^[2]。它的结构骨架由 D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和 L-鼠李糖重复单元构成，侧链由单一的 L-吡喃甘露糖基或 L-吡喃鼠李糖基构成 ，连接鼠李糖的几率占 2/3，此外约有半数的四糖片断上带有乙酰基团^[5,6]。威兰胶的化学组成为 2.8-7.5%的乙酰基，11.6-14.9%葡萄糖醛酸，中性糖甘露糖，葡萄和鼠李糖的摩尔比大致为 1：2：2。鼠李糖末端连接的和 1,4 连接的比例为 1：2，葡萄糖基本上为 1，3 连接^[7]。

Urbani 等人报道水溶液中威兰胶分子主要是分子内的范德华力作用，侧链和主链间的氢键作用^[8]。威兰胶水溶液具有假塑性流体特征，威兰胶在每秒 0.1-1000 的剪切率时表现出剪切稀化，但它对 剪切造成的断裂具有相当的抗性，能在几分钟内恢复几乎所有的内部结构^[9,10]。威兰胶是一种极好的悬浮剂，能在低浓度和低剪切率情况下增加水溶液的粘滞性。威兰胶水溶液对热稳定，在温度提升至 149 #176;C 时，粘度基本不变。在盐水和海水中，威兰胶水溶液的粘度和溶解性与高浓度的二价离子共存。威兰胶水溶液对酸、碱稳定，pH2-13 范围内粘度基本不受影响。低浓度的多糖水溶液即可获得高的粘度，25 #176;C 时 1%的水溶液粘度可达 3300 cp，用此胶作为添加剂可赋予加工产品假塑流体的特征而易于泵送和灌注，便于高固体物质的混合搅拌。威兰胶的具体特性如下：(1)能溶于冷水中，在水溶液中呈现规则、稳定的结构，低浓度的水溶液即具有很高的粘度。（2）具有假塑性流体特性（剪切稀化作用），静止状态下有良好的悬浮能力。（3）在pH 2.0-12.0范围内比较稳定，并且有良好的耐盐性能。（4）威兰胶在1% NaOH存在并加热的条件下能形成凝胶，但其凝胶强度很弱。（5）具有热可逆性，温度对威兰胶水溶液粘度的影响不大，121 ℃下灭菌15分钟其粘度不会下降；0.4%的黄原胶溶液在135 ℃时粘度已趋于零，但同等条件下的威兰胶溶液要到163 ℃时粘度才接近于零。在正常条件下，温度升高造成威兰胶溶液的粘度下降，在温度降低后可完全恢复。（6）与其他胶有很好的兼容性^[11,12]。此外，威兰胶具有令人放心的安全性，它是天然原料发酵而成的生物高聚物，无毒害，易降解，具有良好的环境友好性。

威兰胶可由革兰氏阴性菌Sphingomonas sp.好氧发酵生产，随着威兰胶的积累，发酵液粘度迅速增大，严重制约了氧传递效率，使得溶氧成为威兰胶生产效率提高的重要限制因素。目前提高氧传递速率的方法主要集中在增加搅拌速率或者通气量，然而高强度的剪切力会导致细胞破裂，同时控制泡沫的形成也提高威兰胶生产的经济成本。李会等证实提高搅拌速率可促进细胞生长但是会降低威兰胶的分子量以及威兰胶产量。朱萍等将氧载体添加入威兰胶的发酵体系，结果表明氧载体的加入可提高发酵体系的的溶氧水平以及氧传质效率，但是氧载体昂贵的价格成为该方法的限制因素。目前没有人利用分子手段对威兰胶生产菌株进行改进以提高氧传递速率。

2. 透明颤菌血红蛋白的发现及应用

透明颤菌血红蛋白（vitreoscilla hemoglobin，VHb）是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白，VHb在透明颤菌中被发现，最初被认为是”细胞色素o(cytochrome o, Cyo)”蛋白，具有末端氧化酶的性质^[13]，实验表明该蛋白在光谱学和氧结合动力学性质上与氧合肌红、血红蛋白相似。1986年，Wakabayashi等结合蛋白质初级结构、光谱性质、氧结合动力学确定了该蛋白的结构^[14]，并将该蛋白正式命名为透明颤菌血红蛋白。该蛋白能使透明颤菌在低氧条件下生存并保持较高的生长速率，近年来在生物工程领域的应用越来越广泛^[15]。目前已有将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）转化入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等的报道，菌体在低氧条件下的生长速率以及次级代谢产物的产量均有所提高。然而，并没有透明颤菌血红蛋白基因应用在威兰胶中的报道。