论文总字数：13669字

摘 要

利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）是一种潜在的植物生防菌，其产生的胞外抗真菌物质在植物病害的防治中起着重要的作用。本研究旨在对利迪链霉菌产胞外抗真菌物质的发酵条件进行优化。通过对因素试验及梯度实验筛选出利迪链霉菌最佳培养基配方及发酵条件，通过发酵液对黑斑病病原菌链格孢霉的抑制率作为评价指标。实验结果表明：利迪链霉菌培养最佳条件为接种量10％，选择葡萄糖为碳源。蛋白胨为氮源，PH在6.5到7.0之间。利迪链霉菌生长最佳温度为30℃，摇床转速220r/min。利用筛选出的最适发酵培养基和发酵条件培养利迪链霉菌，菌丝生长速度快产孢外抗真菌物质的抑菌效果最好。

关键词：利迪链霉菌；发酵培养基；发酵条件优化；抗菌物质

Optimization of fermentation conditions for antifungal substances production by Streptomyces lydicus

Abstract

Streptomyces lydicus (Streptomyces lydicus) is a potential plant biocontrol bacterium, and its extracellular antifungal substances play an important role in the control of plant diseases. The aim of this study was to optimize the fermentation conditions of Streptomyces liddiae producing exosporal antifungal substances. The optimum medium formula and fermentation conditions of Streptomyces litti were selected through factor test and gradient test, and the inhibition rate of fermentation broth to Streptomyces litti, the pathogen of black spot, was used as the evaluation index. The results showed that the optimum culture condition of Streptomyces lidi was 10% inoculation amount and glucose was selected as carbon source. Peptone is a nitrogen source with a PH between 6.5 and 7.0. The optimum temperature for the growth of Streptomyces liddy was 30℃, and the rotating speed of the shaking table was 220r/min. The optimal fermentation medium and fermentation conditions were selected to cultivate Streptomyces litti. The growth rate of hyphae was fast and the antibacterial effect of exosporal antifungal substances was the best.

Key words: Streptomyces lydicus; Fermentation medium; Fermentation optimization; antimicrobial substance

目录

摘要 2

Abstract 2

目录 3

第一章 前言 4

1.1选题背景 4

1.2 放线菌 4

1.2.1 利迪链霉菌的来源及分类 5

1.2.2 利迪链霉菌产代谢产物的意义和应用 5

1.3发酵培养 6

1.3.1 利迪链霉菌发酵需要控制营养要素 6

1.3.2 利迪链霉菌发酵需要控制的环境条件 7

第二章 实验部分 8

2.1 药品和仪器 8

表2-2实验使用仪器信息 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 菌种活化 9

2.2.2 制备种子液 10

2.2.3 接种样的优化 10

2.2.4 发酵温度的优化 10

2.2.5 溶氧量的优化 10

2.2.6 平底与挡板的不同 10

2.2.7 碳源优化 10

2.2.8 氮源优化 10

2.2.9 无机盐的优化 10

2.2.10各种氨基酸的优化 10

2.3.1 培养方案一 10

第三章 结果与讨论 13

3.1 利迪链霉菌发酵条件优化初步研究 13

3.1.1 实验方案一数据结果 13

3.1.2 实验方案二数据结果 14

3.2 OD与相对抑菌率的折线统计图 15

3.3 分析讨论 18

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

第一章 前言

1.1选题背景

近年来农业生产因植物病害损失惨重，真菌所引发的占80％以上，比如蔬类作物的灰霉病、炭疽病、番茄叶霉病、水稻稻瘟病、玉米大小斑病、小麦赤霉病等。欧美、澳洲、非洲、日本、印度等国家因灰霉病所引致的田间产量损失一般在20-30％，我国在黄淮东北和西北温室集中的地方蔬菜灰霉病病害严重，田间产量损失在30％左右，严重的高达50-70％。目前蔬菜生产中对灰霉病还没有找到合适的抗源材料，研究抗病育种的进展缓慢，化学药剂仍旧被该病害的防治所依赖。但是化学农药的长期大量应用，不但严重污染人们的生活环境、破坏生态平衡、威胁人畜的健康和安全，而且也会给病原生物产生抗药性，使得病害更加猖獗且难以防治。据消息称，近年来，防治灰霉病的两类主要农药苯并咪唑类和二甲酰亚胺类的个别药剂已引起了灰霉病菌的抗药性，田间防效下降明显。同时，果蔬产品的农药残留超标也成为了其在出口创汇方面的主要障碍。而微生物农药源于自然，其特点为环境兼容性好、持效期长、低毒、对人畜和天敌安全等，与此同时又资源丰富，在植物尤其是果蔬病害控制中是重要绿色环保途径之一，符合农业可持续发展的要求。因此，近年来在全球范围内微生物农药发展的极其迅速。

1.2 放线菌

放线菌属于革兰氏阳性菌，其是一类主要呈菌丝状生长并且以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。放线菌广泛分布在含水量较低，有机物质比较丰富的微碱性的土壤中，一般雨后我们所闻到的“泥土的芳香”主要就是放线菌产生的土腥味素所引起的。链霉菌是放线菌的典型代表，链霉菌细胞呈丝状分支，菌丝直径很细，一般小于1μm，与细菌相似，在营养生长阶段，一般呈多核单细胞形态；当其孢子落在固体培养基上，便开始发芽、伸长、分枝，形成大量具有吸收外界营养物质和排泄代谢废弃物功能的基内菌丝体；基内菌丝体生长到一定阶段，并开始向空中生长的菌丝体称为气生菌丝体；气生菌丝体成熟便分化成孢子丝，并通过横割分裂方式，产生大量的分生孢子。孢子丝的形态有直线型，弯曲型，钩状，螺旋状等多种形态，孢子丝分隔形成的孢子链及孢子的形态是链霉菌分类的依据之一。

1.2.1 利迪链霉菌的来源及分类

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)是长期居住于土壤的腐生微生物，是链霉菌的一种，经过长期研究，它能产生多种抗菌活性物质。有名的代表菌株为S.lydicus NRRL2433，该菌株广泛应用于医药领域，能够生产出具有分枝杆菌和广谱抗细菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗分枝杆菌和革兰氏阳性细菌的利迪链菌素(Streptolydigin)。在植物病害防治上应用较广的菌株是S.lydicus WYEC 108，此菌株最早于英国农业土壤分离出来，以重寄生的方式作用于土传病害的病原菌，能够定殖在植物的根尖部位，包括丝核菌(Rhizoctonia)、腐霉菌(Pythium)、轮枝菌(Verticillium)、顶囊壳(Gaeumannomyces)、镰刀菌(Fusarium，)等属真菌的种类，也能分泌几丁质酶从而破坏真菌的细胞壁。此外还有菌15748, 它能够产生抗肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)等革兰氏阴性细菌的苹果酸氧霉素(Malioxamycin)的。还有能产生抗金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性细菌的菌株 2249-S3, 它能生产抗生素 Lydicamycin 。以及产生能够抗厌氧菌的多肽类抗生素Chandramycin 的菌株;菌株WYEC108在植物病害防治上应用较广,定殖在植物的根尖部位,菌寄生于土传病害病原菌,分泌几丁质酶破坏真菌的细胞壁。国内还报道了菌株 23在离体条件下对番茄溃疡病菌 (Clavibacter michiganense subsp. michiganense)表现出很强的拮抗作用，在国外该菌株在用于植物根腐病、种子腐烂病等病害的生物防治上已开发出活菌制剂。

1.2.2 利迪链霉菌产代谢产物的意义和应用

约植物病害的 70%～80%都是由植物病原真菌引起的。据有效估算，全球每年的植物真菌病害可导致小麦、水稻、马铃薯、黄豆和玉米减产超过1.2亿t。如果能抑止其发展，每年可多养活约6亿人。因此植物真菌病害的防治是尤为重要。链霉菌（Streptomyces）能够产生大量具有广谱抑菌活性的抗真菌抗生素和分解真菌细胞壁的酶，60%以上用于农业的抗生素都来源于链霉菌属，因此链霉菌被被称为重要的工业微生物，它的开发潜力在植物真菌病害的生物防治中是巨大的。真菌细胞壁主要由甘露糖、β-1,3-葡聚糖和几丁质等组成，因此有着β-1,3-葡聚糖酶活性和几丁质酶活性的物质变成抑菌活性药物近年来开发的热点。

1.3发酵培养

菌种生长、繁殖和合成产物用的最多的就是发酵培养基。它既能够使种子接种后能快速生长，到达我们所需要的菌丝浓度，又能使成长完全的菌体迅速合成我们所需的产物。因此发酵培养基的分配应丰富，必需的碳源氮源的互相搭配应注意速效和迟效，少用速效营养，多加迟效营养；碳氮比也尤其重要，稳定pH值用缓冲剂；并且还要加入菌体生长所需的生长因子和产物合成所需要的元素、促进剂和前体等。还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等来保证产物的获得。但若生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同，或生长和生物合成产物所需要的总的磷源、氮源、碳源等的浓度太高时，则可通过分批材料来满足所需营养。

1.3.1 利迪链霉菌发酵需要控制营养要素

碳源

主要功能：

1）是菌体生长和繁殖的能源物质，也是合成浸提的必需成分；

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