论文总字数：16205字

摘 要

利迪链霉菌（Streptomyces Lydicus）是近年来备受产业界和学术界关注的一种生防菌，它能够产生多种抗菌活性物质，促进植物生长和防治植物病害。为了对利迪链霉菌M01次级代谢产物中抑菌活性的物质进行鉴定，将利迪链霉菌M01孢子液接种PDA培养液，获得发酵液；首先通过乙酸乙酯萃取，旋转蒸干，获得抗菌物质粗提取物。然后通过硅胶柱层析，使用三氯甲烷和甲醇梯度洗脱；将获得所有样品溶液用滤纸片法进行生物活性测试，将具有对应活性的组分合并蒸干。得到的抑菌活性组分进而通过C18反相液相色谱检测，比较各组分生物活性，将具有较高生物活性的组分旋转蒸发除去有机溶剂后冷冻干燥得到纯度较高的抗真菌物质。最后通过高分辨质谱仪初步分析得出利迪链霉菌M01分泌的抗菌物质为利迪链霉素C₁₀H₁₄N₂O₃S。

关键词：利迪链霉菌 次级代谢产物 抗菌物质 发酵

Isolation and Preliminary Identification of Extracellular Antibacterial Substances of Streptomyces lydicus

Abstract

Streptomyces Lydicus is a biocontrol fungus that has received much attention from industry and academia in recent years. It can produce a variety of antibacterial active substances to promote plant growth and prevent and control plant diseases. In order to identify the antimicrobial activity of the secondary metabolites of Streptomyces lydicus M01, the spore liquid of Streptomyces lydicus M01 was inoculated with PDA culture broth to obtain the fermentation broth; firstly, it was extracted with ethyl acetate and spin-dried to obtain antibacterial Crude extract of substance. Then through silica gel column chromatography, using chloroform and methanol gradient elution; all sample solutions obtained were tested for biological activity by filter paper method, and the components with corresponding activities were combined and evaporated to dryness.The obtained antibacterial active components were further purified by C18 reversed-phase liquid chromatography to compare the biological activities of the components. The components with higher biological activities were rotary evaporated to remove the organic solvent and then freeze-dried to obtain anti-fungal substances with higher purity. Finally, a preliminary analysis by high-resolution mass spectrometry showed that the antibacterial substance secreted by Streptomyces lydicus M01 was streptomycin lidi C10H14N2O3S.

Keyword：Streptomyces lydicus; secondary metabolites; antibacterial substances; fermentation

目录

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 前言 Ⅲ

1.1链霉菌概述 1

1.2 链霉菌的多样性 1

1.2.1土壤链霉菌 1

1.2.2海洋链霉菌 2

1.2.3植物内生链霉菌 2

1.3 链霉菌产生的农用抗生素 3

1.3.1源于链霉菌的抗菌剂 3

1.3.2源于链霉菌的杀虫剂 4

1.3.3源于链霉菌的除草剂 4

1.4 链霉菌在生物防治方面的作用方式 5

1.4.1抗生作用 5

1.4.2重寄生作用 6

1.4.3促进植物生长作用 6

1.4.4诱导植物产生抗性 6

1.5 实验研究意义 7

第二章 实验部分 8

2.1 药品和仪器 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 菌种和培养基 9

2.2.2 利迪链霉菌M01发酵液的制备 9

2.2.3 提取用有机溶剂的选择 9

2.2.4 大孔树脂吸附柱层析 10

2.2.5 硅胶吸附柱层析 10

2.2.6 滤纸片法测抑菌活性 11

2.2.7 抗菌物质的C18反相液相色谱检测 11

2.2.8 高分辨质谱测定 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 有机溶剂的选择 12

3.2大孔树脂分离层析结果分析 12

3.3链霉菌粗提取物硅胶柱层析分离 13

3.4链霉菌粗提取物抗菌物质C18反相HPLC检测 14

3.5高分辨质谱测定 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 前言

1.1链霉菌概述

放线菌属于革兰氏阳性菌，其是一类主要呈菌丝状生长并且以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。放线菌广泛分布在含水量较低，有机物质比较丰富的微碱性的土壤中，一般雨后我们所闻到的“泥土的芳香”主要就是放线菌产生的土腥味素所引起的。链霉菌是放线菌的典型代表，链霉菌细胞呈丝状分支，菌丝直径很细，一般小于1μm，与细菌相似，在营养生长阶段，一般呈多核单细胞形态；当其孢子落在固体培养基上，便开始发芽、伸长、分枝，形成大量具有吸收外界营养物质和排泄代谢废弃物功能的基内菌丝体；基内菌丝体生长到一定阶段，并开始向空中生长的菌丝体称为气生菌丝体；气生菌丝体成熟便分化成孢子丝，并通过横割分裂方式，产生大量的分生孢子。孢子丝的形态有直线型，弯曲型，钩状，螺旋状等多种形态，孢子丝分隔形成的孢子链及孢子的形态是链霉菌分类的依据之一。

1.2 链霉菌的多样性

1.2.1土壤链霉菌

链霉菌在自然界中分布广泛，在土壤，海洋，空气中都可捕捉到其踪影。在陆地上，土壤使其最主要的栖息所，土壤的理化性质，气候，营养物质，植被覆盖情况都影响着链霉菌种类及数量以及次级代谢物分泌情况。我国幅员辽阔，具有各种气候带，生物数量十分丰富，因此不同地区的情况都不一样。链霉菌对人类及植被的关系及其密切，绝大多数都属于有益菌。在放线菌目中，链霉菌产生的抗生素占50%以上。近年来筛选到的许多新的生化药物有很多都是链霉菌的次生代谢物，包括抗癌剂，酶抑制剂，抗寄生虫剂，农用杀虫剂等。许多链霉菌产生的酶，维生素以及具有分解纤维素，角蛋白，琼脂等能力，对有害菌的抑制、环境保护、提高土壤肥力和自然界物质循环中起不可替代的作用。苏道拉呼^[1]在内蒙古草原土壤中分离到的链霉菌S1能够合成几丁质酶，其可以降解真菌细胞壁并且抑制病原菌菌丝的生长，对桃褐腐病原真菌和平菇褐斑病原细菌有很好的抑制作用，并且经研究发现链霉菌S1代谢产物对番茄根结线虫的杀线活性最高可达90%。圆圆^[2]等人在我国青海湖附近植被根系土壤中的微生物分离筛选得到的链霉菌S-101对尖镰孢菌和草莓炭疽菌具有很好的抑制作用，能有效防治黄瓜枯萎病。

1.2.2海洋链霉菌

科研人员在上世纪70年代开始对海洋放线菌展开研究。海洋链霉菌主要分布在近海和前海区域，一般栖息于海洋动植物体表、体内、海水及海底沉积物中^[3]；其中海洋沉积物因含有丰富腐殖物质，养分充足，是海洋链霉菌最喜欢聚集的地方。由于海洋链霉菌所处环境的特殊性(低温，低氧，高渗透压等)，因此发现部分海洋链霉菌产生的化合物的结构以及生物活性与陆地链霉菌有着显著的差异。通过几十年的研究，科研人员发现海洋链霉菌产生的次生代谢物型涉及生物碱类、蒽醌类、内酯类、萜类、肽类、脂肪酸类、黄酮类等^[4][5]; 这些成分具有抗菌、抗肿瘤、抗癌、消炎、抗病毒等生物活性，因此近几年对海洋链霉菌的研究也越来越多。李慧玲^[6]等人对海洋链霉菌Streptomycessp. S598进行研究，分离纯化该菌株的次级代谢物，获得五个单体化合物，这些化合物具有广谱抗菌活性，并且对MRSA和白色念珠菌具有很好的抗菌活性。曲承蕾^[7]等人在中国烟台逛荡河入海口沉积物样品中分离到海洋链霉菌Streptomycessp.223，并在其次级代谢物中发现１个新的二酮哌嗪类化合物并且对HeLa肿瘤细胞具有较好的抑制活性。

1.2.3植物内生链霉菌

植物内生放线菌是指放线菌生活史的部分或全部存在于健康植物的各种组织和器官内部并且对宿主植物不构成危害。它们能够从植物根部表皮或侧根的裂隙进入根部，并随着根部的生长发育进入植物中柱等组织，从而在细胞间隙或细胞内生长、繁殖，并分泌很多有生理功能的次生代谢物。典型的例子是生长在水稻根部并且具有固氮功能的巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense），生长在甘蔗、水稻、高粱根部具有固氮能力的织片草螺菌（Herbaspirillum seropedicae）等。目前，对于植物内生放线菌的研究开始逐渐增多每种植物都是一个独立且复杂的生长环境，多样的环境也给我们提供了新的可能。从植物内生菌中获得的化合物有近一半都是新的化合物，因此植物内生菌具有很大的发展潜力。李文均^[8]等人对我国西南及西北地区许多植物的内生放线菌进行了研究，发现了许多新品种放线菌，他们从西双版纳热带雨林中分离到了2174个内生放线菌菌株，其中至少有19个为新品种。Coombs^[9]等人从小麦根部分离出60多种放线菌，并在其中筛选出防治小麦全蚀病的菌种，经温室实验发现该菌株可以是小麦全蚀病的危害降低70%。耿琦^[10]等人从黄瓜中分离出的淡紫灰链霉菌对番茄早疫病、灰霉病、玉米弯孢病、辣椒疫霉病具有显著的抑制效果。

1.3 链霉菌产生的农用抗生素

1.3.1源于链霉菌的抗菌剂

如今的防治措施几乎都是使用合成农药，虽然多数情况下对害虫或者病菌的抑制杀灭效果都不错，但随着使用次数和使用量的增多，有的病菌渐渐形成了抗药性，此外农药制剂会生物链积累，从而导致生态环境的破坏并会损害人类的身体健康。因此运用链霉菌“以菌治菌”将会降低农药对自然环境伤害程度的一个新的突破口。

源于链霉素的抗菌剂作用机制主要是与细菌的核糖体不可逆地结合在一起进而干扰蛋白质的合成。并且与青霉素仅对革兰氏阳性菌有效这一杀菌谱不同的是，链霉菌对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效。美国最早于1952年把链霉素应用在农业上防治梨、苹果上的火疫病。后来发展到12种植物上，用于防治马铃薯晚疫病、黑胫病，烟草野火病，黄瓜角斑病、霜霉病，芹菜细菌性疫病，大白菜软腐病等。目前应用到农业上的抗生素主要有灭瘟素，春日霉素，多氧霉素，米多霉素，井岗霉素，万隆霉素等，它们都是从不同链霉菌发酵液中提取出来的，对原核细菌具有很好的抑制效果。如春日霉素^[11]，在1963年从卡氏链霉菌发酵液中提取出来，具有内吸杀菌作用，在我国多地也能发现其踪影。春日霉素通过与病原菌细胞质中的核糖体产生不可逆的结合来抑制其蛋白质合成，对稻瘟菌、白菜软腐病、菜豆晕疫病、黄瓜细菌性角斑病等具有很好的抑制作用，并且它对植物的毒性很低，有很好的植物安全性。随着研究的不断深入，科研人员也陆续发现了一些源于链霉菌的抗生素对某些真菌也有很好的抑制效果。巴西的C^[12]等人从13个链霉菌中筛选出7株对黑化真菌进行抗菌活性评估，经测试，大部分链霉菌的次生代谢物对黑化真菌均有机制作用，只有一株放线菌抑制效果比较差。这突出了放线菌具有抗真菌活性的潜力。

1.3.2源于链霉菌的杀虫剂

目前源于链霉菌的杀虫剂成分主要有米尔贝霉素，阿维菌素，秦岭霉素，杀螨素等。米尔贝霉素是从 20世纪70年代从Streptomyces hygroscopicus subsp. Arueolacrimosus的发酵液中分离得到的，发酵液中包含着20中结构不同的米尔贝霉素，它们对农业害虫具有光谱防治活性，如蚜虫，螨虫，黄褐天幕毛虫等。米尔贝霉素和阿维菌素作用机理相同，其主要作用机理是作用于GABA即2-氨基丁酸来阻断害虫中枢神经传送系统，使害虫麻痹致死。秦岭霉素是西北农林科技大学研究人员从秦岭土壤中分离的一株放线菌中得到的,研究表明其发酵产物对多种植物病原真菌和细菌具有较强的抑制作用,它包含两种抗菌物质，一种是阿维菌素，另一种是内酰胺类抗生素。韩小美^[13]通过组合抗生素抗性突变法选育了高产秦岭链霉菌菌株，对高产菌株的发酵条件进行了优化并且对高产菌株的前体添加方案进行了改善，最终得到的菌株对供试病原真菌的毒力是出发菌株的1.5～5.4倍。杀螨素是第一个商品化的杀虫抗生素，金色链霉菌S-3466和灰色链霉菌ATCC12648均能产生杀螨素^[14]。

1.3.3源于链霉菌的除草剂

源于链霉菌的除草剂成分主要有双丙氨磷，茴香霉素等。双丙氨磷，是1971年首先从 Streptomycesviridochromogenes和S.hygroscopicus中分离得到,最初发现其具有抗真菌活性和抗细菌活性, 并能强烈的抑制大肠杆菌中的谷酰胺合成酶^[15][16]; 后来发现双丙氨磷双丙氨磷通过水解分裂出丙胺酸显示出除草活性^[17] 。茴香霉素，是从 Streptomyces sp.发酵液中分离得到的, 其在单子叶植物（水稻、稗等) 、马唐以及双子叶植物（紫花苜蓿、番茄等）上使用^[18]。Hydantocidin，从 S .hygroscopicus SANK 63584 的发酵液中分离得到的抗生素，N^[19]等人将其与双丙氨磷等17中除草剂作比较，发现其对一年生单子叶植物和双子叶植物稍大于双丙氨磷，而且Hydantocidin在1000μg/mL都没有抗微生物活性，对哺乳动物和鱼类都是低毒性。Hydantocidin 的作用机理是进入植物细胞后在植物体内被代谢为hydantocidin-5-磷酸盐，该化合物可以抑制腺苷酸琥珀酸合成酶的产生，从而导致植物不能产生腺苷酸琥珀而抑制其生长^[20][21]。陈尧^[22]等人从桉树根际土壤分离了14株放线菌，其中链霉菌A10发酵液稀释液对紫花苜蓿的根长和株高抑制率分别为52.71%和6.10%, 具有潜在的抑制杂草的开发利用价值。

1.4 链霉菌在生物防治方面的作用方式

1.4.1抗生作用

抗生作用，也称拮抗作用，一般情况下是指一些微生物会通过产生抗生素等物质来抑制其它生物的生长发育甚至直接杀死其它生物，来使自身最大化的使用周边的营养资源，促进自身的生长、发育、繁殖。日常生活中典型的例子是厌氧菌的发酵：在好氧菌和兼性厌氧菌消耗掉残存的氧气后，就为厌氧菌（乳酸菌等）的发育繁殖提供了一个良好的环境。这些厌氧菌后续也会产生乳酸等物质来对其它腐败菌产生拮抗作用。在农业上，之前所讲到的比如井冈霉素、春日霉素、庆丰霉素、灭瘟素等在农作物和森林病虫防治方面产生的作用正是拮抗作用。在生物防治方面，链霉菌主要通过产抗生素来限制其它生物生长。这些抗生素产生作用的机理主要是抑制微生物细胞壁、蛋白质或 RNA 合成、破坏细胞膜完整性或者抑制靶标生物电子传递链等。申嗪霉素是我国首创的农用抗生素，其分泌的吩嗪-1-羧酸具有氧化还原能力，在真菌细胞内积累活氧，抑制线粒体中呼吸转递链的氧化磷酸化用，从而抑制菌丝的正常生长，引起植物病原真菌菌丝体的断裂、肿张、变形和裂解。申嗪霉素之前一直用于水稻纹枯病、稻瘟病，小麦赤霉病、黄瓜灰霉病、霜霉病，辣椒疫病，西瓜枯萎病上，刘刚^[23]将其用于烟草上来防治烟草黑胫病，结果表明，1%申嗪霉素悬浮剂对烟草黑胫病的防治效果为 84.37%，远大于市场上常用的农药。

1.4.2重寄生作用

目前报导的重寄生菌主要是重寄生真菌。比如邓勋^[24]发现樟子松疱锈病的锈孢子和发病组织中分离得到45 株真菌，通过形态鉴定和序列测定，分离真菌属于6 属9种，包括链格孢、木霉、镰刀菌、毛霉等。目前发现的链霉菌重寄生现象也有，但比较少，所以在生物防治方面并没有体现出太大的成效。王海清等人^[25]研究发现，土壤链霉菌R5可以通过菌丝缠绕、紧贴、穿透的方式重寄生于病原菌辣椒疫霉病菌和烟草黑胫病菌的菌丝上，使病菌因无法正常生长而死亡。

1.4.3促进植物生长作用

链霉素除了能产抗生素，其还能产生一些其它活性物质，比如吲哚乙酸（IAA），嗜铁素，ACC脱氨酶，丙二醛（MDA）等。有些链霉菌还有良好的固氮、解磷能力，也能很好的促进植物生长。吲哚乙酸，一种植物生长素，在植物生长阶段，其作为一种调节生长的信号物质。吲哚乙酸主要生物学功能是促进植物生长、增大细胞体积和质量。植物根际促生菌有一半可以合成IAA；此外IAA可以吸收富集土壤中的重金属，减少重金属对植物的损害。孙佳瑞^[26]等人发现根际链霉菌S506可以产生吲哚乙酸，并且对有机磷具有较强的溶解和利用功能。林睿^[27]从内蒙古不同地区的土壤中分离出8种链霉菌，其中四种供试链霉菌具有产氨、产脲酶、产铁载体及产ACC脱氨酶能力,产吲哚乙酸量在13.01-66.93μg/mL范围之内,解磷能力在2.34-20.22 μg/mL之间。除此之外，这8种链霉菌均能促进马铃薯幼苗生长,且均可有效促进圣女果种子萌发。

1.4.4诱导植物产生抗性

链霉菌不仅能帮助植物抵御生物虫害带来的危害，还能在帮助植物适应非生物逆境上起到比较理想的作用。比如能够帮助薄荷有效缓解水渍逆境带来的负面影响，其甚至能降解长期在农田残留的农药制剂。张穗^[28]通过研究发现吸水链霉菌不仅能够产生井冈霉素，还能增强水稻叶片中的过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶( PAL) 的活性，使植株产生抗性防御反应，防御纹枯病的发生。段春梅^[29]等人以黄瓜幼苗为实验材料，发现接种三种防治链霉菌，提高了叶片诱导酶PPO的含量，其对根系生长及活力的促进作用尤为明显, 并使黄瓜产生诱导抗性。刘宇^[30]等人发现接种利迪链霉菌A02后再接种灰霉病菌后，植物细胞分泌的苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性提高，这能提高番茄植株各防御酶系的活性，从而使植株增强对灰霉病菌的抵御能力。

1.5 实验研究意义

利迪链霉菌对植物有很明显的促生和病害防治的作用。利迪链霉菌本身会产生很多种次级代谢产物，其中有一些具有生物活性的物质，这些物质对利迪链霉菌代谢及其应用有重要的意义。本研究通过对利迪链霉菌MO1发酵液上清中的抗菌物质进行分离和纯化，对抗菌物质的结构进行初步鉴定，将为利迪链霉菌及其代谢产物在农业方面的应用打好坚实的理论基础，拓展人们对利迪链霉菌促生抗病机制的认识。

第二章 实验部分

2.1 药品和仪器

表2-1 实验使用药品信息

表2-2实验使用仪器信息

2.2 实验方法

2.2.1 菌种和培养基

菌种：利迪链霉菌（S. lydicus）M01，本实验室保存。链格孢菌（A.alternata），购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

固体斜面培养基：可溶性淀粉 20 g/L，葡萄糖 5 g/L， 蛋白胨 2 g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，酵母粉 2 g/L，琼脂 20 g/L，121 ℃ 蒸气灭菌 20 min； PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，琼脂18g，121℃蒸气灭菌 20 min。

2.2.2 利迪链霉菌M01发酵液的制备

将利迪链霉菌M01接种于斜面培养基上，放在恒温28℃培养箱中培养7d；用无菌水从利迪链霉菌M01表面洗下孢子，用三层擦镜纸过滤，得到迪链霉菌M01孢子液（1.1*10⁸/mL孢子）将孢子液以1.0%比例接种于PDA培养基中，在恒温28℃，恒速150r/min条件下震荡培养3d，将液体收集后离心，收集上清液即获得利迪链霉菌M01发酵液。

2.2.3 提取用有机溶剂的选择

将得到的发酵液取 90 mL 分别用等体积的乙酸乙酯、三氯甲烷、正己烷混合，静置一会，直到水相与有机相完全分层，反复萃取 2 次，合并有机相，旋转蒸发（37℃）至干燥，将获得的干物质用 2 mL 甲醇溶出。萃取后余液采用旋转蒸发除去残留的有机溶剂溶剂。以链格孢菌作为生物测定对象，采用带毒平板法测定不同有机溶剂的萃取相和萃取余液的菌活性，根据抑菌活性圈的大小选择合适的有机溶剂作为萃取剂。

2.2.4 大孔树脂吸附柱层析

使用40cm*2.5cm的RD105玻璃分离柱，柱装体积为150mL。对X-5大孔树脂进行预处理：将树脂与4%HCl混合后在磁力搅拌器上离心1.5-2h；取出用砂芯漏斗过滤7-8次（以500ml烧杯为单位）；将滤渣与4%NaOH混合，重复上述操作；用95%乙醇浸泡二次过滤后的树脂，湿法上样填入分离柱中。配500mL50%乙醇，200 mL 50%甲醇；量取大于200 mL发酵液，先用布氏漏斗抽滤，再用垫了定性滤纸的砂芯漏斗抽滤，最后量大约200mL滤液。调节样品上柱流速至4mL/min；样品上完后调节流速为2mL/min，用甲醇（150ml）洗脱；将离心装置与自动分馏收集器连接，设置时间为5min/管，每管10mL共计45管，将虹吸管插入乙醇中，按从右至左的顺序依次打开开关，自动收集。每管分别用链格孢菌作为指示菌进行活性测定，合并活性洗脱液，用等体积的乙酸乙酯萃取两次；37℃旋转蒸发至干燥，得到褐色固态提取物，用少量甲醇溶解后保存。

2.2.5 硅胶吸附柱层析

使用40cm*1.0cm的玻璃层析柱。取15g硅胶，对其进行预处理：110℃下烘2h后与200mL 4%HCl混合在磁力搅拌器上离心1.5-2h；取下静置一会，倒去上清液，加水中和PH；在砂芯漏斗中垫上一层定性滤纸后浑浊液抽干；将滤渣与200mL 2%NaOH混合，在磁力搅拌器中搅拌1.5-2h，后将混合液倒在100mL离心管中（误差lt;1g），在8000r/min转速下离心5min，取出后倒出上清液加清水，保持重量一致，继续离心，重复此操作5次；取出后用500ml 95%乙醇浸泡，搅匀 。湿法上样，用5ml移液枪吸取上层溶液移入离心柱中。取上述方法得到的提取物2g，用少量甲醇溶解滴入分离柱中。洗脱剂用三氯甲烷和甲醇梯度洗脱 (9:1的三氯甲烷、甲醇至1:1的三氯甲烷、甲醇，共五组， V/V)，每个梯度洗脱1-2个分离柱，调节上柱流速至0.8mL/min, 将分离装置与自动分馏收集器连接，设置时间为5min/管，每管4mL共计125管，将虹吸管插入第一组洗脱剂中，按从右至左的顺序依次打开开关，自动收集。

2.2.6滤纸片法测抑菌活性

用无菌水从链格孢菌表面洗下孢子，用三层擦镜纸过滤，得到链格孢菌孢子液。在超净工作台上倒PDA平板，凝固后倒置放入30℃培养箱中，2d后观察平板上是否有菌落，没有则进行下一步。在超净工作台上用移液枪移取0.1mL链格孢菌孢子液与各个平板中，用涂布器涂匀。在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水作对照组，每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用移液枪吸1mL样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，放进4℃冰箱24h。培养24h后取出倒置放入30℃恒温培养箱中，24h后观察结果。经过硅胶柱层析，生物测定后，将有生物活性且极性一致的组分合并后蒸干。

2.2.7 抗菌物质的C18反相液相色谱检测

将经过硅胶柱层析和滤纸片法测生物活性后的有抑菌效果的组分进行C18反相液相色谱检测。色谱条件为：柱温30℃，TSKgel ODS-120T色谱柱（4.6* 250mm，TOSOH,Japan），检测波长为206nm，流速 0.4 mL /min，进样量10μL，洗脱溶剂为纯水/乙腈梯度洗脱，采用二元泵，A 泵为去纯水，B 泵为乙腈，洗脱次序为 0 min -10 min 95% A 5% B；10 min-15 min为85% A 15% B；15 min-45 min 为85% A 15% B。见峰收集。将收集的各组分进行生物活性测定，将具有较高生物活性的组分旋转蒸发除去有机溶剂后冷冻干燥得到纯度较高的抗真菌物质。

2.2.8 高分辨质谱测定

将得到的纯度较高的抗菌物质1和抗菌物质2溶解于色谱甲醇。质谱条件：9.4T Apex Q-FT-MS，毛细管电压4kV，离子源温度180℃，扫描范围(m/z) 300-2000, 泵流速1.0mL/min。数据在正离子和负离子模式下采集。

第三章 结果与讨论

3.1 有机溶剂的选择

通过三氯甲烷，乙酸乙酯，正己烷对利迪链霉菌M01发酵液滤液的萃取；以各种萃取物和萃取后余液对链格孢菌菌丝生长的抑制作用来评价各有机溶剂的效果。结果表明，发酵液经乙酸乙酯提取后，乙酸乙酯粗提物对链格孢菌的菌丝生长表现出很强的抑制作用。相反，经乙酸乙酯提取后的余液对链格孢菌表现出较弱的抑制作用，说明乙酸乙酯能有效地将发酵液中的抗真菌物质提取到有机相中，因此选用乙酸乙酯作为萃取剂是最优的选择。（表3-1）。

表3-1 不同有机溶剂萃取效果

3.2大孔树脂分离层析结果分析

有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩不同目的。对收集到的45管洗脱液样品进行活性测定，结果表明14-26管具有抑菌活性，可用于后续实验（图3-1）。

图3-1 各样品经生物活性测定结果分析

3.3链霉菌粗提取物硅胶柱层析分离

常用洗脱剂极性（由小到大）：石油醚＜环己烷＜苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜甲醇＜水。选用三氯甲烷和甲醇，随着洗脱液溶剂极性慢慢增大，极性不同的两种抗菌活性物质便全部被洗脱下来（图3-2），然后旋转蒸发至干燥。

图3-2：分离得到两种不同极性的抑菌物质

3.4链霉菌粗提取物抗菌物质C18反相HPLC检测

取经过硅胶吸附柱层析和生物活性测定后的提取物2g，用少量色谱级甲醇溶解，通过C18反相色谱检测1号物质和2号物质(图3-3，图3-4，图3-5)。

图3-3：菌株M01活性产物纯化前HPLC分离图谱

图3-4：菌株M01活性产物纯化后获得的1号物质HPLC分离图谱

分别在7min、9min、30min出现吸收峰。

图3-5：菌株M01活性产物纯化后获得的2号物质HPLC分离图谱；分别在

7min和9min出现吸收峰。

3.5高分辨质谱测定

M01活性产物的质谱图（3-6）中, 采用正、负离子检测方式检测确定了该抗菌化合物的分子量为 242.293, 并解析出其分子式为C₁₀H₁₄N₂O₃S; 基于以上质谱数据，波长，与现有文献数据参考，初步鉴定该化合物为利迪链霉素，CAS号为10118-85-1 。结构式见图3-7。

图3-6：菌株M01菌株 A02 活性产物的高分辨正离子质谱图。

图3-7：利迪链霉素分子结构式

第四章 结论与展望

4.1 结论

本章通过对利迪链霉菌M01的培养，用有机溶剂对链霉菌M01发酵液进行萃取、浓缩从而得到发酵液的粗提物，使用大孔树脂柱层析，硅胶柱层析，C18反相液相色谱等分离技术从粗提物中分离检测到1种抗真菌物质。经过高分辨质谱仪解析了所分离的抗真菌物质是利迪链霉素。

4.2 展望

2020年国家发布《中国农业展望报告（2020-2029）》，介绍了稻米、小麦、玉米、大豆等18个主要农产品2019年的市场形式，对未来10年的生产、消费、贸易、价格走势进行了展望。随着农业产业用地，技术的改革，势必需要更加有效的措施去在规定的土地上生产出更多，更绿色无公害的农作物。链霉菌在此方面的优势就由此体现出来。随着国家和政府越来越重视生态环境的保护和发展，农业生物制剂即使不能立刻完全取代传统农药，但这种逐渐趋势却是大势所趋。首先，利迪链霉菌对植物的促生特性可以显著降低传统磷肥等农田肥料的使用量，从而降低对农田的伤害并使农田可持续利用率提高。其次，利迪链霉菌对植物病害的防治也可以有效提高农作物产量，减少经济损失。所以利迪链霉菌在农业方面的价值将是巨大的，而本研究对利迪链霉菌活性代谢产物的坚定将为利迪链霉菌及其代谢产物在农业方面的应用打好坚实的基础。

参考文献

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致谢

本论文从开始选题到资料的收集、实验的操作以及论文的最终修改成稿都是在王明轩老师的悉心指导下完成的。同时在整个实验过程中，王老师治学态度严谨，对很多问题都有独到精确的解决办法，这也让我在整个实验过程中学会了许多东西，受益匪浅。再次，谨向我的导师表示感谢！

同时我也要向无时无刻不在帮助我的薛师兄表示衷心的感谢。是薛师兄细心地帮助我纠正实验过程中的操作细节，帮助我避免不必要的时间的浪费。也感谢师兄也能在百忙中还能耐心回答我的疑惑，在此再次表达衷心的感谢！

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