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摘 要

黄曲霉毒素B1（AFB1）对食品的污染问题非常严重。为了提高AFB1检测的效率，降低检测成本，本研究旨在开发一种经济且灵敏的适体传感器，用于检测食品样品中的AFB1。本文利用G-四联体-氯化血红素（Hemin）配合物具有类辣根过氧化物酶活性，在过氧化氢（H₂O₂）存在下，能够催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）发生反应，产物显蓝色并且在波长λ=370 nm处有紫外-可见吸收的方法来比较加入AFB1前后溶液体系的颜色和紫外可见吸收光谱变化。当加入AFB1后，茎环结构打开，相互结合形成G-四联体，再与加入的Hemin反应结合，形成G-四联体-Hemin配合物，随着AFB1浓度增加，形成的G-四联体-Hemin配合物的浓度相应增加，催化作用增强，蓝色变深，峰值逐渐变大。因此，通过基于G-四联体/Hemin比色法可检测出样品中的黄曲霉毒素B1。

该配合物对AFB1具有较高灵敏度，与报道的其他试剂相比更加经济，可以用于检测食品中的AFB1，未来也可能在其他食品污染物测定中得到广泛的实际应用。

关键词：黄曲霉毒素B1 G-四联体 TMB 类辣根过氧化物酶活性

Rapid detection of aflatoxin B1 in food based on G-quadruplex/Hemin colorimetry

Abstract

The problem of food contamination of aflatoxin B1 (AFB1) is very serious. In order to improve the efficiency of AFB1 detection and reduce the cost of detection, this study aims to develop an economical and sensitive aptamer sensor for detecting AFB1 in food samples. In this paper, the G-quadruplex-Hemin complex has a horseradish peroxidase activity, which can catalyze the reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) in the presence of hydrogen peroxide (H₂O₂), and the product showed a blue color and UV-visible absorption at a wavelength of λ = 370 nm to compare the color and UV-visible absorption spectrum of the solution system before and after the addition of AFB1. When AFB1 was added, the stem-loop structure was opened and combined to form a G-quadruplex, which was then combined with the added Hemin reaction to form a G-quadruplex-Hemin complex. As the AFB1 concentration increased, the G-quadruplex formed. The concentration of the body-Hemin complex increases correspondingly, the catalytic effect is enhanced, the blue color becomes deeper, and the peak value gradually becomes larger. Therefore, aflatoxin B1 in the sample can be detected by a G-quadruplex/Hemin colorimetric method.

The complex has high sensitivity to AFB1 and is more economical than other reported reagents. It can be used to detect AFB1 in foods and may be widely used in other food contaminant determinations in the future.

Key Words: Aflatoxin B1；G-quadruplex-Hemin complex；TMB；Horseradish peroxidase activity

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 前言 1

1.2 黄曲霉毒素的种类和危害 2

1.3 G-四联体-Hemin生物模拟酶简介 3

1.3.1 G-四联体-Hemin生物模拟酶的作用机理 3

1.3.2 G-四联体与Hemin的作用方式 4

第二章 实验与材料 6

2.1 药品、试剂和仪器 6

2.1.1 药品和试剂 6

2.1.2 仪器 7

2.2 实验部分 7

2.2.1 实验原理 7

2.2.2 实验操作 8

2.2.3 原理验证 10

2.3 条件优化 10

2.3.1 氧化反应时间的确定 10

2.3.2 实际检测AFB1样品的可行性及其效果 11

2.4 公式和计算 11

第三章 结果与分析 12

3.1 原理验证 12

3.2 条件优化 13

3.2.1 TMB氧化反应时间的确定 13

第四章 结论与展望 17

4.1结论 17

4.2展望 18

参考文献 19

致谢 23

第一章 绪论

1.1 前言

霉菌毒素是存在于食品、饲料等农副产品中的一类有毒因子，对人和动物具有普遍的毒性危害。最常见的霉菌毒素有黄曲霉毒素B1（AFB1），赭曲霉毒素A（OTA），玉米赤霉烯酮（ZEA）和伏马菌素（FB1）等^[1-2]。目前为止，己鉴定出400种霉菌毒素的化学结构以及其对人体的毒性影响^[3]。其中黄曲霉毒素B1，M1，赭曲霉素A对人类具有致癌性，还可诱发突变、导致畸形等^[4]。霉菌毒素危害大，污染范围广，同时在实际生产生活中要完全避免霉菌毒素对食品及饲料的污染非常困难，例如食物被OTA污染后，即使是在烹饪、烘焙和发酵的过程中，也不会减少其在食品中的含量^[5-6]。因而，不但要在食品加工环节防止霉菌污染，还要对食物、饲料等增强监管，及时发现问题物，避免其进入食物链。

由于毒性危害大，污染范围广，人们对黄曲霉毒素检测防治研究工作从未停止过。近年来，研究者们建立了一系列AFB1的检测方法，有几种涉及色谱的技术，主要包括液相色谱法、气相色谱法和质谱法等仪器分析方法^[7-8]，荧光和免疫检测，表面增强拉曼散射（SERS）以及基于抗体的酶联免疫反应等^[9]。虽然色谱法是高度敏感和可重复的，但由于仪器法需要专业的技术人员且前处理复杂，不利于大通量的对食品进行筛查，昂贵的仪器和材料以及长时间的分析过程，它们不适用于快速和现场检测筛查AFB1。除此以外，荧光信号极易遭到外部环境和共存物种的干扰。免疫测定的性能取决于运输和储存过程中抗体的稳定性，而抗体又十分昂贵且不稳定，容易出现假阳性、假阴性检测结果，这常常妨碍其准确性和效率。另一方面，长的AFB1适体（50bp）会在金属纳米颗粒（NPs）之间产生大的间隙，导致弱的SERS信号。因此，通常需要间接方法和更复杂的操作来实现AFB1的检测。所以，开发出一种快速、灵敏、易于使用操作且成本低廉的黄曲霉毒素AFB1的检测方法显得尤为重要。

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