论文总字数：17226字

摘 要

不用的细菌胞外多糖有着不同的生理功能，在食品、药品等领域都有出现它们的身影，因此，研究细菌胞外多糖的提取工艺和构效关系以便开发它们的生产和应用价值，这对我国制糖工业的发展很有帮助。

骆驼刺泛菌胞外多糖的基本信息研究非常少，限制了其应用发展。本实验选取骆驼刺泛菌NX-11对其胞外多糖的提取纯化以及结构进行研究。粗提多糖的产量为8.7 g/L。研究发现其单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖，重均分子量M_w为8683749 Da。EPS中有较多的1→2糖苷键，1→4糖苷键和未被高碘酸钠氧化的1→3糖苷键，以及少量的1→6糖苷键，扫面电镜放大后观察到EPS样品表面呈块状紧密排列。

关键词：骆驼刺泛菌 胞外多糖 纯化 结构鉴定

Purification and structure identification of exopolysaccharide from Pantoea alhagi

Abstract

Different bacterial extracellular polysaccharides have different physiological functions and are found in food, medicine and other fields. Therefore, it is very helpful for the development of sugar industry in China to study the extraction process and structure-activity relationship of bacterial extracellular polysaccharides so as to develop their production and application value.

Studies on the basic information of exopolysaccharides from Pantoea alhagi limited its application. During this period, the extraction and purification technology and primary structure of extracellular polysaccharides produced by Pantoea alhagi NX-11 were studied. The yield of crude polysaccharide was 8.7 g/L. It is made up of galactose, mannose and glucose. There were many 1→2 glycosidic bonds, 1→4 glycosidic bonds and 1→3 glycosidic bonds that were not oxidized by sodium periodate, and a small amount of 1→6 glycosidic bonds in EPS. The sample surface was observed to be blocky and compact after magnification. The average weight molecular weight is 8683749 Da.

Key Words: Pantoea alhagi; Extracellular polysaccharide; Purification; Structure identification

目录

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 绪论 1

1.1细菌胞外多糖的研究进展 1

1.1.1胞外多糖研究现状 1

1.1.2细菌胞外多糖的定义以及分类 1

1.1.3细菌胞外多糖的化学结构 2

1.1.4细菌胞外多糖的理化性质 2

1.2多糖一级结构研究方法 2

1.2.1单糖的组成分析 2

1.2.2单糖的分子量测定 3

1.2.3高碘酸钠氧化 3

1.2.4红外光谱 4

1.3论文研究的目的与内容 4

1.3.1研究的目的 4

1.3.2研究内容 4

第二章 材料与方法 5

2.1引言 5

2.2实验材料与仪器 5

2.2.1实验材料 5

2.2.2实验器材 6

2.3实验方法 7

2.3.1骆驼刺泛菌NX-11胞外多糖的发酵 7

2.3.2发酵液的粗提 7

2.3.3胞外多糖的纯化 8

2.3.4化学组分测定方法 8

2.3.5多糖的单糖组分分析 10

2.3.6多糖的分子量测定 10

2.3.7多糖的高碘酸钠氧化 10

2.3.8多糖的红外光谱分析 11

2.3.9多糖的扫描电镜分析 11

第三章 结果与讨论 12

3.1骆驼刺泛菌NX-11胞外多糖的粗提 12

3.2 EPS的分离纯化 12

3.3 EPS的化学组成 13

3.4 EPS中多糖结构的测定与分析 14

3.4.1 EPS单糖组分分析 14

3.4.2 EPS的分子量分析 15

3.4.3 EPS的高碘酸钠氧化 15

3.4.4 EPS的红外光谱分析 16

3.4.5 EPS的扫描电镜分析 17

3.5结果与展望 18

参考文献 19

致谢 21

第一章 绪论

1.1细菌胞外多糖的研究进展

1.1.1胞外多糖研究现状

十九世纪八十年代人们第一次发现了细菌胞外多糖，直到二十世纪中期才开始应用细菌胞外多糖^[1]。之后尽管有大量的胞外多糖被陆续报道，他们的结构、性质被研究，但是仍有大部分多糖未能实现工业化，等待人们去研究。不仅要对其应用的研究，还要注重其构效关系，同时降低其生产、纯化成本，让更多具有价值的胞外多糖被开发出来，促进我国胞外多糖工业的发展。泛菌一般存在于植物表面，在土壤、水、动物中也可以分析得到，种类分布广泛^[2]。臧聚玲^[3]对一株泛菌胞外多糖研究发现其具有很好的抗辐射功能以及保湿能力。研究还发现^[4]，菠萝泛菌胞外多糖可以修复肠道损伤，调节肠道内微生物菌群的平衡。

1.1.2细菌胞外多糖的定义以及分类

细菌生产的多糖有的留在细胞内称为胞内多糖，有的称为细胞壁的一部分叫胞壁多糖，还有的被细胞排出体外，我们把它称为胞外多糖。胞外多糖还可依据于与菌体结合的松紧程度又分为荚膜多糖与粘液多糖。形成的原因是有的多糖分子由于发生共价结合，吸附于细胞表面，这就形成了荚膜多糖。然而有的大分子量或是小分子量多糖并不能与细胞牢固结合，因此会被细胞排出体外形成粘液多糖^[5]。粘液多糖有时会通过某种特殊机制粘附在细胞的表面，同样，荚膜多糖也可能会脱落到外部环境中^[6-7]。通常一种细菌只生产一种多糖，有一小部分细菌能够生产结构一样的粘液多糖和荚膜多糖，甚至还有一小部分细菌在自生的生长和繁殖过程中具备生产出两种以上多糖的能力^[8]。有学者还研究出胞外多糖能够保护细胞不受外界恶劣环境的影响，比如高温或低温，由此可见细菌的生长发育离不开胞外多糖的保护^[9-10]。

1.1.3细菌胞外多糖的化学结构

细菌胞外多糖是由单糖组成，根据不同的糖残基，将其划分为均聚多糖和杂多糖，在各种领域中已经研究发现的的糖残基约有一百种^[11]。常见的有D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖等，不常出现的有核糖、木糖等^[12]。研究胞外多糖的化学结构对我们确定多糖种类与进一步的研究很有帮助。

1.1.4细菌胞外多糖的理化性质

胞外多糖凭借特殊的理化性质使得他们在食品、化工等领域有着丰富的应用。由于分子链上有羧基、羟基等，使得其具有亲水性。此外，与植物多糖比，它的粘度较大，且受温度、pH、无机盐的影响较小，因为这些性状使其在食品工业中成为增稠剂、稳定剂。在胞外多糖的溶液中还有不同的流变性质比如凝胶性、触变性等。在医学领域，根据其生物学功能将胞外多糖做成药物或生物材料。一些荚膜多糖能够作为疫苗使用，因为其具有优秀的免疫原性^[13-14]。研究表明，透明质酸、右旋糖酐、海藻酸可以用来修复受损的心肌组织，在组织工程中这些胞外多糖被广泛应用^[15]。在食品领域，它们受pH、温度等环境影响较小，在预制食品中加入黄原胶可以保持其外观^[16]。在化工领域，以改善环境为例，生物被膜的重要组成成分是细菌胞外多糖，有它的存在，能够改善和保护细菌周围的环境，给细菌提供适宜的生存环境^[17]。研究发现，一些海洋细菌能利用他们的生物被膜净化工业上产生的废水，减少有害物质流入陆地及水生系统^[18-20]。这种利用细菌介导的净化方式与传统方式相比，有着成本低、效率高、避免二次污染等优点。

1.2多糖一级结构研究方法

1.2.1单糖的组成分析

通常选用气相色谱法或是液相色谱法分析。GC（气相色谱）法应用范围很广，可以用来检测空气和水源当中的污染物，食品添加剂的成分等。具有灵敏度好、方法成熟、设备普遍的优点。参考Lehrfeld^[21]的方法，有效的用GC法测得了多糖中的组分，通常用来分析中性糖，分析糖醛酸时困难，因为在水解糖醛酸时容易内酯化。HPLC（液相色谱）法适用于能溶于液体的样品，在医药领域有着广泛应用，在新药筛选、改进现有药物的生产工艺和改良菌群方面有着重要作用。优点是柱效高、重复性好、分析速度快、选择性高、应用范围广，可以测定中、酸性糖。此外，还可使用气相联用质谱分析（GC-MS）。

1.2.2单糖的分子量测定

胞外多糖可以看做是分子量接近高聚物分子的一类混合物，所以它的分子量为平均值，就是平均分子量。研究其分子量及分布，对了解它的性质、功能、用途、加工性能、加工条件、应用范围有很大帮助。报道发现^[22]，右旋糖酐的分子量为1-2×10⁵时红细胞发生聚集反应，接着在2-4×10⁵时红细胞解聚。研究β-葡聚糖的分子量分布范围，对研究它在保健食品中的功效评价有重要意义^[23-24]。采用光散射法测M_w具有检测快、分辨率高、重复性好、测量的粒径范围比较大的特点，但是如果样品中含有混合物测量结果的准确性会受影响。

1.2.3高碘酸钠氧化

高碘酸钠选择性的氧化或断裂多糖分子中的连二羟基或连三羟基，得到是多糖醛、甲醛、甲酸。在实验的测定过程中，我们可以根据每消耗一份子的高碘酸钠就说明有一个C-C键开裂。更加直观的讲就是，多糖样品中糖苷键的位置还有连接顺序，如果是直链多糖那么它的聚合度，如果是支链多糖那么它的分支数目和取代情况，这些都可以在实验中通过高碘酸的消耗量以及甲基的释放量的测算来判断。值得注意的是，不同的多糖分子他们糖基之间缩合位置大不相同，因此在实验过程中高碘酸纳氧化的产物也大不相同。用高碘酸钠氧化1→2糖苷键时，我们从中发现样品分子中每个糖基会与一分子的高碘酸钠反应，反应完成结束后不释放甲酸。接着继续观察用高碘酸钠氧化1→3糖苷键时，这时候加进样品里的高碘酸钠不反应，没有损耗。用高碘酸钠氧化1→4糖苷键时，我们又会从中发现出每个糖基会与一分子高碘酸钠反应，反应完成结束后不释放甲酸。最后我们又使用高碘酸钠氧化1→6或者1→（非还原末端基）糖苷键时，这时候高碘酸参与反应的量会比之前多，经过研究比对出每个糖基会有两分子的高碘酸钠参与反应，同时会有一分子甲酸被释放出。

1.2.4红外光谱

红外光谱能够研究分子振动还有原子间的极性共价键，优点有不破坏样品、测量频率宽、精度高等。在进行多糖结构定量定性分析中意义重大。在多糖的红外光谱图中特征峰比较明显^[25]。糖羟基的伸缩振动出现在3600-3200 cm^-1间的宽峰，根据以往的资料C-H伸缩及变角振动分别为3000-2800 cm^-1、1400-1200 cm^-1，磷酸基的伸缩振动峰在1300-1250 cm^-1。

1.3论文研究的目的与内容

1.3.1研究的目的

细菌胞外多糖有着出色的理化性质和生物学功能，在食品、医学、工业等领域有着很广泛的应用。降低新多糖的生产提纯成本，研究新多糖的理化性质以及基础构效关系，为不同领域的胞外多糖进行新品开发和扩大市场。因此，研究和发展胞外多糖有着及其重要的意义。

本论文研究的骆驼刺泛菌NX-11具有很高的开发研究价值。对骆驼刺泛菌NX-11胞外多糖进行制备、提取纯化、结构鉴定，为以后的开发研究提供基础。

1.3.2研究内容

第一部分首先通过对菌种进行培养、转接、发酵得到粗多糖的发酵液，然后进行粗提，使用离心法、过滤法等进行除菌、除蛋白、除色素，接着通过DEAE纤维素柱和凝胶色谱柱来分离纯化多糖，测量纯多糖的糖含量、糖醛酸含量、灰分含量等进行分析。

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