论文总字数：15622字

摘 要

本实验研究了产生物活性物质培养基各组分对利迪链霉菌菌体生长的影响, 并筛选出主要对其生长产生影响的因素为碳源种类、氮源种类、液体培养基的初始pH及接种时的接种量。后续设计正交实验以测定最佳的主要影响因子浓度。通过实验测定结果,经过优化的种子培养基中利迪链霉菌的生物量相较于初始培养基得到提高。经优化后的培养基成分为2%葡萄糖作为碳源，2%豆粕粉作为氮源，培养基中另需加入其余5种无机盐：(NH₄）₂SO₄ 0.25%，MgSO₄·7H₂O 0.075%，KH₂PO₄ 0.03%，NaCl 0.5%，CaCO₃ 0.4%。该种培养基中培养的利迪链霉菌经过测定在解淀粉欧文氏菌培养基上形成的抑菌圈直径达到了1.9 cm，较大地提升了培养基的抑菌物质产量。

关键词：利迪链霉菌, 种子培养基, 优化, 正交实验设计

Optimization of fermentation conditions of bacteriostatic substances produced by Streptomyces lydicus M01

Abstract

In this study, the effects of various components of the production active substance medium on the growth of Streptomyces lydicus were studied, and the main factors influencing its growth were selected as carbon source type, nitrogen source type, initial pH of liquid medium and inoculation quantity. Orthogonal experiments were subsequently designed to determine the optimal concentration of the main influencing factors. The biomass of Streptomyces lydicus in the optimized seed medium was increased compared with the initial medium. The optimized medium composition was 2% glucose as carbon source, 2% soybean meal powder as nitrogen source, and the remaining 5 inorganic salts (NH₄) ₂SO₄ 0.25%, MgSO₄·7H₂O 0.075%, KH₂PO₄ 0.03%, NaCl 0.5%, CaCO₃ 0.4%) were added to the medium. The diameter of bacteriostatic circle formed by Streptomyces lydicus cultured in this medium reached 1.9 cm on the culture medium of orvinella starch, which significantly increased the yield of bacteriostatic substances in the medium.

Key words: Streptomyces lydicus, seed medium, optimization, orthogonal experimental

目录

利迪链霉菌M01产抑菌物质发酵条件的优化 I

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1生物防治与土传疫病 1

1.2解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovory）和梨火疫病 1

1.3农业抗生素 2

1.4链霉菌的生物防治机制 2

1.5利迪链霉菌 4

第二章 材料与方法 5

2.1实验试剂 5

2.2实验仪器 5

2.3供试菌株和基础培养基 6

2.4微生物发酵实验方法 6

2.5碳源，氮源，pH值，接种量的初步筛选 7

2.6平板对峙法检验利迪链霉菌抑菌效果 8

2.7正交实验设计 9

2.8正交实验取样生长情况测定 11

第三章 结果与分析 13

3.1利迪链霉菌优化培养最适碳源、氮源、接种量及初始pH值的初步筛选 13

3.2正交实验筛选利迪链霉菌优化培养最适碳源氮源配比及最适初始pH 17

第四章 结论与展望 20

致谢 21

参考文献 22

第一章 文献综述

1.1生物防治与土传疫病

集约化农业造成的土壤有机质损失和土壤微生物多样性及活性的相关损失，是土壤植物病害增加的原因之一。土壤传播疾病每年造成相当大的农业作物损失，土壤传播疾病的管理被确定为全球农民面临的首要农场管理问题之一^[1]。农用化学品通常用于土壤传播疾病的管理。然而，化学药品的频繁使用、非靶标效应、对化学杀虫剂的病原体耐药性的发展、对人类健康和周围环境的风险，以及诸如甲基溴等一些有效的土壤熏蒸剂的逐步淘汰，促使了疾病管理替代方法的发展。近年来，生物活性物质（如纳他霉素）在土壤中的应用已被证明具有抑制土传病害和叶传病害的潜力，因此，若能开发利用生物发酵工程产生的生物活性物质在防治土传疫病中的应用，将可以缓解土传疫病带来的农作物减产。根际微生物与植物生长促进和抑制土著病原体在许多方面:增加营养的可用性和吸收,生产植物生长刺激荷尔蒙,与病原菌竞争资源,生产化合物抑制病原体,寄生于病原体,甚至诱导系统性植物抵抗病虫害在许多植物物种。此外，微生物类群和功能多样性和活性以前与植物生长促进，植物防御系统的激活和土壤传播疾病的抑制有关。植物种类，植物生长发育阶段，植物生长的环境，包括土壤类型、pH值、湿度、温度和是否添加土壤有机改进剂等，都会对植物根部微生物群落的构成及其活性产生影响。^[2]

1.2解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovory）和梨火疫病

由解淀粉欧文氏菌（E.amylovory）造成的梨火疫病可对蔷薇科植物造成侵染，该过程将会对被感染植物造成巨大伤害。而在世界范围内蔷薇科植物的种植范围最为广泛。蔷薇科植物中，苹果树和梨树在世界范围内都是最为重要的两类落叶果树，其带来的经济效益之广泛，使人们意识到了对于梨火疫病的防治成了一个迫在眉睫的问题。通过王宇霖的报道，全球分别有88个和76个国家将苹果和梨作为经济植物^[3]。正因如此，世界诸国目前都非常重视梨火疫病的防治。在中国，梨火疫病被规定为检疫性病害，虽然这种病害在我国暂时尚未被发现，但如果不做好严格的疫情调查，不对梨火疫病进行相应的了解和调查，不掌握检验检疫梨火疫病的检测技术，梨火疫病在未来的某天将可能会对我国农业经济造成巨大影响。因此，本实验室展开实验，优化对于梨火疫病等土传疫病的生物防治手段。

1.3农业抗生素

抗生素研究为人类治疗微生物感染提供了多种结构多样且有效的药物。农业抗生素作为自然资源的生物产品，越来越受到人们的关注，越来越强调环境友好和安全的作物综合管理。抗生素是由不同种类的放线菌产生的。放线菌目成员，尤其是链霉菌属，是广泛存在于自然环境中的一类重要微生物。链霉菌是革兰氏阳性的土居菌丝细菌，具有复杂的生命周期。自从在链霉菌中发现链霉素以来，链霉素被证明是一个特别丰富的抗生素来源，产生了所有已知抗生素的50%，以及许多抗癌、抗真菌和免疫抑制剂^[4]。众所周知，抗生素的生物合成可能会随着培养基组成和发酵条件的不同而变化。即使培养基中的微小变化也可能不仅影响某些化合物的数量，而且影响微生物的一般代谢特征。在开发工业发酵系统时，发酵介质和培养条件至关重要，因为它们显著影响产品浓度、产量和体积生产力。

1.4链霉菌的生物防治机制

通过前人对于链霉菌用于生物防治的机制研究表明，链霉菌用以作用生物防治的机理主要有：竞争作用、诱导作用、拮抗作用，能够对土传植物病害起到有效的防治效果。此外，链霉菌对于植物真菌病害的防治并不是通过单一的一种作用方式而达成目的，而通常都是通过上述几种途径共同作用以产生效果，并且不同的生物防治机制之间同样也存在着协同的效果^[5]。

1.4.1拮抗作用

拮抗作用是一种常见于生物界中的作用方式，其在链霉菌生物防治机制中的体现通常为：链霉菌能够产生一些次生代谢物质用以对其他植物病原微生物产生抑制作用，例如：从盐碱地中分离出的产水链霉菌可以对盘核盘菌引起的油菜菌核病产生明显的抑制作用。

1.4.2竞争作用

竞争作用时生物防治用链霉菌产生其机能的一种主要机制，其包含了以下两点：营养的竞争和康健的竞争。在使用链霉菌进行生物防治时，植物根部末端以及土壤中有限的空间将会受到生物防治用链霉菌的竞争，该过程会导致病原菌的生长空间收到压缩，从而减少植物根部病原菌的数量，进一步达到降低病原菌对植物侵染的作用。营养竞争是指生物防治用链霉菌对于病原菌所必须的包括水分、碳源、氮源等的营养成分具有抢夺的作用，例如：某些链霉菌能够以分泌嗜铁素从而加速土壤中铁离子的被利用速率。通过这种途径能够对病原菌对于铁离子的需求产生抑制作用，进而减少病害。

1.4.3诱导作用

生物防治用链霉菌在对病原菌产生抑制作用的同一时间，将会对病原菌寄生的宿主植物产生相应的作用。此处称该现象为链霉菌用于植物真菌病害防治时的诱导作用，这种作用方式一般情况下能够诱导植物启动其抗性反应，对植物整体对于病害菌的防御机制起到增强的作用。在此过程中，通过链霉菌的诱导作用而引发的抗性反应通常能够使植物系统获得一定的抗性。前人的研究发现，吸水链霉菌在产生井冈霉素的同时，也可以促进水稻叶片中的过氧化物酶活性，该过程将应发植物的抗性防御反应，抵御纹枯病的危害。

1.5利迪链霉菌

利迪链霉菌在生物防治中的应用主要依赖其能够发酵产出大量天然活性物质的特点，其中编号为NRRL2433的利迪链霉菌菌株最具有代表性。该菌能够产出利迪链霉素，对分岐杆菌及革兰氏阳性细菌产生广谱抗性。在植物病害防治方面，WYEC108为利迪链霉菌中使用较为广泛的菌株，其作用机理为：WYEC108利迪链霉菌于植物的根尖部分定殖，以菌寄生的方式对土传染病害细菌产生作用效果。此外，该菌株也有分泌能够破坏真菌细胞壁的几丁质酶的能力。大约百分之七十到百分之八十的植物病害是由于植物病原真菌引起。所以，据此估计，该类真菌病每年造成的包括水稻，小麦，玉米，土豆和大豆在内的约1.25吨的减产如果能得到抑制，即若能控制植物真菌病的传播，有额外的6亿人将能够获得充足的粮食。据此统计数据来看，对于植物真菌病害的防治目前尤为重要。在研究对于植物真菌病害防治时发现链霉菌属具有产生大量光谱抗真菌抗生素的功能，此外还有分解真菌细胞壁的功能。实际上百分之六十以上的能够适用于农业的抗生素类生物活性物质来源于链霉菌属。据此统计，链霉菌因其在对于真菌病害进行生物防治时所拥有的巨大潜力而被认定为一种极为重要的工业微生物。真菌细胞的细胞壁主要的组成为：甘露糖、几丁质、-1，3-葡聚糖。因而，对几丁质和-1，3-葡聚糖有酶活性的生物物质近年来成为了抑制植物真菌病害的生物农药的开发热点。

利迪链霉菌所产霉素是一种效率非常高的抗生素，能够灭活或抑制所有的真菌及酵母菌。该种霉素导致细胞死亡以达到生物防止功能的作用机理为：通过与真菌的细胞膜中的麦角固醇专一结合的能力，从而对真菌的细胞膜结构和生理功能产生影响，最终导致细胞凋亡。这种生物层面的抑菌手段相较于一般通用的化学试剂法，有着诸多如下优势：所需剂量低;效率高；适应多样pH条件；有效作用时间较长等。而对于长期使用该种霉素的设想来说，其最为重要的特性是在长期应用于生物防治中时，并未发现过在目标真菌中形成一定抗药性的实验结果。对其目标真菌进行高浓度霉素培养以人工诱导，该条件下仍未发现有形成抗性的菌株。此外，对于哺乳类动物，该种霉素不具有毒性，并无因其而产生突变、畸形、过敏、癌症等个例存在。

第二章 材料与方法

2.1实验试剂

2.2实验仪器

2.3供试菌株和基础培养基

2.3.1 利迪链霉菌M01种子活化

将菌液和60%甘油等体积混合的甘油管（2 mL）接种至TSB平板培养基（胰蛋白胨 1.5%，大豆蛋白胨 0.5%，氯化钠 0.5%）中，经过7天震荡培养，设定培养温度为30℃，得到活化的种子。

2.3.2 种子液制备

将2.3.1中得到的种子液以1%的接种量于新的TSB培养基（胰蛋白胨 1.5%大豆蛋白胨 0.5%氯化钠 0.5%接种前加入灭菌玻璃珠）中接种，设定摇床转速为200 rpm，温度为30℃，震荡培养两天（约48 h），通过此步骤可得后续发酵实验所用的种子液。

2.3.3 培养基母液的制备

本实验中葡萄糖采用母液添加的形式加入，具体配置方案为：葡萄糖200 g，用RO水溶解并定容至500 mL，配置为400 g/L的葡萄糖母液，115℃灭菌后备用

2.4微生物发酵实验方法

碳源，氮源，无机盐等多种因子都在一定程度上影响着微生物的培养以及其代谢产物的产出。而对发酵培养基进行优化的关键是快速寻找锁定关键因子，并对其进行优化。每次改变一个因子，重复进行实验筛选合适因子通常被称为多因子实验,本实验采用了多因子实验方法方法设计，优先筛选出最适宜的氮源、碳源。在后续实验确定了最适宜接种量及初始pH后，采用正交实验确定了最适宜碳氮源浓度配比。

2.5碳源，氮源，pH值，接种量的初步筛选

2.5.1基础培养基

葡萄糖20 g，可溶性淀粉10 g，酵母粉10 g，蛋白胨5 g，(NH₄)₂SO₄ 2.5 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，KH₂PO₄ 0.3 g，NaCl 5 g，CaCO₃ 4 g。

2.5.2培养条件

摇床发酵培养：将利迪链霉菌菌株接种至培养基，维持摇床转速200 rpm，维持发酵温度为30℃。

2.5.3利迪链霉菌发酵条件碳源的优化

本实验选取发酵常用的碳源：蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉。为考察利迪链霉菌在不同碳源浓度条件下的发酵情况，将配置的培养基中碳源以5g作为浓度梯度进行改变，以筛选得到菌株发酵培养的最佳碳源浓度。保持其他组分一致，以浓度10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L分别配置培养基，对碳源进行优化实验。培养96 h后，取20 μl接种于解淀粉欧文氏菌涂布平板中，观察测量其抑菌圈的有无，若有，测量其直径。

2.5.4利迪链霉菌发酵条件氮源的优化

本实验中选取了常用的氮源：蛋白胨、玉米浆干粉、尿素、豆饼粉、豆粕粉。在最佳碳源培养基的基础上，以5 g为浓度梯度加入浓度分别为5 g，10 g，15 g，20 g，25 g的氮源配置成培养基，考察利迪链霉菌菌株在不同氮源浓度情况下的生长情况，以遴选获得菌株发酵培养的最适氮源浓度。培养96 h后，取20 μl接种于解淀粉欧文氏菌涂布平板中，观察测量其抑菌圈的有无，若有，测量其直径。

2.5.5 利迪链霉菌发酵条件pH值的优化

在通常情况下利迪链霉菌的培养pH控制在7.2，因此本实验将pH在7.2上下调整，设置为5，6，7，8比较不同初始pH条件下菌株的生长状况，培养96 h后，取20 μl接种于解淀粉欧文氏菌涂布平板中，观察测量其抑菌圈的有无，若有，测量其直径，依据抑菌圈的有无及其直径大小，筛选菌株发酵最适宜pH。

2.5.6 利迪链霉菌发酵条件接种量的优化

本实验在该范围内选取0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%为每个培养基基础的利迪链霉菌接种量，分别评测初始接种量对利迪链霉菌培养的影响，培养96 h后，取20 μl接种于解淀粉欧文氏菌涂布平板中，观察测量其抑菌圈的有无，若有，测量其直径。测量相关参数筛选出培养最佳的初始接种量。

2.5.7 利迪链霉菌培养条件优化检验

利用利迪链霉菌产抗菌物质对欧文氏菌生长的抑制，通过扩散法测定不同培养条件下利迪链霉菌对欧文氏菌生长的抑制性能。具体做法为在定量浓度菌液的培养基上，将欧文氏菌培养相同的一段时间后，使用接种环将相同浓度的不同条件下培养的利迪链霉菌菌液接种于欧文氏菌培养基上，测量其抑菌环的直径大小，以确定欧文氏菌对不同条件下培养的利迪链霉菌的相应敏感程度。

2.6平板对峙法检验利迪链霉菌抑菌效果

使用平板对峙法初步确定最适碳源种类，氮源种类，接种量及pH

2.6.1含菌平板的制作

以解淀粉欧文氏菌为指示菌，取一环已经过活化备用的解淀粉欧文氏菌接种于10 ml液体TSB培养基中，放入200 rpm，30℃摇床中震荡培养过夜（约12h）。取出培养完毕解淀粉欧文氏菌菌液，将其以TSB培养基稀释10倍。另配置TSB固体培养基，取灭菌完毕的TSB培养基倒平板，等到平板凝固完毕后，使用无菌移液枪移取100 μl经过10倍稀释的欧文氏菌菌液，用灭菌完毕的涂布器均匀涂布于TSB平板上，制作含解淀粉欧文氏菌平板以备用。

2.6.2滤纸片法测定待测菌体抑菌活性

用打孔器打取直径为6 mm的滤纸片，将取得滤纸片置于玻璃容器中进行高温灭菌处理，取出至烘箱干燥20 min后备用。将上述灭菌滤纸片贴于含菌平板上，用无菌移液枪移取20 μl进过优化培养基培养的利迪链霉菌菌液至滤纸片上，等待至菌液干燥完毕，将培养基移至30℃培养箱培养。培养时间取24 h，培养完毕取出后测量抑菌圈直径。每一组优化培养基所取样品进行三次重复实验，算出抑菌圈直径的平均值。

2.7正交实验设计

初步筛选出利迪链霉菌的最适宜碳源种类、氮源种类、接种量后，以碳源浓度、氮源浓度、pH作为变量设计正交实验，以筛选最适宜的碳氮源浓度及pH配比。按照表1的正交实验设计，根据所需的培养基体积，按照表2中的结果添加各物质的量，并根据需要添加的葡萄糖母液的量，根据表3确定添加葡萄糖母液前各培养基定容至的体积。

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