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摘 要

蛋白酶是可以水解蛋白质肽链的一类酶，广泛存在于自然界中，在很多工业生产中均有广泛的应用。在学校内及周边地区采取土壤样品，使用干酪素筛选平板及脱脂奶粉筛选平板进行筛选方法的对比，筛选出可以将菌株周围培养基水解为透明的目标菌株。通过比较产蛋白酶菌株菌落周围透明圈直径与菌落直径的比值，选取比值最大的作为样品土壤中筛出的高产蛋白酶菌株进行后续研究。通过细菌革兰氏染色及分子生物学Biolog方法综合鉴定为解脲棒杆菌。对高产蛋白酶菌株进行初步发酵产酶，最大酶活为2319.668U/mL。

通过单因子变量试验，优化细菌的发酵培养基配方及产酶条件，发现该细菌产酶的最适发酵培养基为蛋白胨6g或黄豆粉6g（更加经济），蔗糖7.5g，MnSO₄0.04g，初始pH为中性7.0，1000ml水；最佳装液量75mL；发酵最适温度37℃；发酵时间55h时酶活最大；摇床转速180r/min。使用优化后的发酵培养基配方及发酵条件，测得该菌株所产蛋白酶最大酶活为2778.615U/mL,与初步发酵所测得的最大酶活相比，提高了19.8%。

关键词：蛋白酶 细菌 发酵 酶活

Screening and identification of high-yield strains in nature

Abstract

Proteases are a class of enzymes that hydrolyze protein peptide chains. They exist widely in nature and are applied widely in many industrial processes. Soil samples were taken in and around the school, and the screening methods including the casein screening plate and the skim milk powder screening plate were compared to screen out the target strain which can hydrolyze the protein to produce a transparent circle. By comparing the ratio of the diameter of the transparent circle around the colony of the protease to the diameter of the colony, the highest ratio of the high-yield protease strains in the sample soil was selected for subsequent study. It was identified as Corynebacterium urealyticum by bacterial Gram staining and molecular biology named Biolog. The high-yield protease strain was subjected to preliminary fermentation to produce enzyme, and the maximum enzyme activity was 2319.668 U/mL.

Through the single factor variable test, the fermentation medium formula and enzyme production conditions of the bacteria were studied. It was found that the optimum fermentation medium for the enzyme production of the bacteria was,6g of peptone or 6g of soybean powder (more economical), 7.5g of sucrose,MnSO ₄ 0.04g, initial pH is neutral 7.0, 1000ml water; 75mL fermentation broth; fermentation optimum temperature 37 °C; fermentation time 55h when enzyme activity is maximum; shaker speed 180r/min.Using the optimized fermentation medium formula and fermentation conditions, the maximum enzyme activity of the protease produced by the strain was 2778.615 U/mL, which was improved 19.8% compared with the maximum enzyme activity measured by the preliminary fermentation.

Keywords：protease; bacteria; fermentation; enzyme activity

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1蛋白酶的简介 1

1.2.一些蛋白酶的应用 1

1.2.1 木瓜蛋白酶 1

1.2.2菠萝蛋白酶 1

1.2.3中性蛋白酶 2

1.3蛋白酶高产菌株介绍 2

1.3.1粘质沙雷氏菌 3

1.3.2枯草芽孢杆菌 3

1.4本文的研究内容 3

1.4.1菌株的处理与富集 3

1.4.2菌株的筛选与纯化 3

1.4.3菌株的鉴定与酶活测定 4

第二章 实验方法 5

2.1实验材料及仪器 5

2.2样品来源 6

2.3培养基配方 6

2.4实验方法 7

2.4.1目标菌株的筛选 7

2.4.2菌株产酶能力的初步测定 7

2.4.3高产蛋白酶菌株的鉴定 7

2.4.4发酵时间对菌株产酶的影响 9

2.4.5发酵条件对菌株产酶的影响 9

2.4.6培养基中配方成分对菌株产酶的影响 10

第三章 结果与讨论 11

3.1产蛋白酶菌株的筛选结果 11

3.2产蛋白酶菌株的鉴定 12

3.3初步酶活测定 12

3.3.1 酶活计算公式数据测定 12

3.3.2反应时间对产酶的影响 13

3.4 发酵产酶的培养基优化 14

3.4.1 碳源种类对产酶的影响 14

3.4.2 碳源浓度对产酶的影响 15

3.4.3 氮源种类对产酶的影响 16

3.4.4 氮源浓度对产酶的影响 16

3.4.5 无机盐种类对产酶的影响 17

3.4.6无机盐浓度对产酶的影响 18

3.5 发酵的条件对产酶的影响 18

3.5.1装液量对产酶的影响 18

3.5.2 温度对产酶的影响 19

3.5.3 pH对菌株产酶的影响 20

3.6 验证试验 21

第四章 结论与展望 22

4.1结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致谢 26

第一章 前言

1.1蛋白酶的简介

蛋白酶是可以水解蛋白质肽链的一类酶 ^[1]。自然界中有很多种蛋白酶，在很多动植物体内及土壤水体中均有发现，按照性能可以分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶^[2]。蛋白酶作为应用最广的一种工业用酶,大约占酶制剂产量的60%以上,广泛应用于各种领域 ^[3]，如加酶洗衣粉中通常添加碱性蛋白酶,减少含磷化合物的用量,减轻洗衣粉对于环境的污染^[4]。动植物及微生物来源的蛋白酶在食品生产中均有应用，其中微生物蛋白酶具有可获取微生物种类多、生长扩增速度迅速和培养方法比较简便等优点^[5]，因此，研究有关高产蛋白酶菌株的课题一直具有较大的意义。

1.2.一些蛋白酶的应用

1.2.1 木瓜蛋白酶

从木瓜中提取出的木瓜蛋白酶，天然安全，活力高，可高效水解多种蛋白质，性质稳定不易受影响，所以被广泛应用于在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业。

在食品行业中，通过使用木瓜蛋白酶水解啤酒中的蛋白质，避免冷藏引起的浑浊，；水解胶原蛋白和肌肉蛋白使肉质更加细嫩，还有鱼类加工和饲料添加剂；在医疗卫生行业中，具有抗癌抗菌的作用，可以消炎止痛，促进食物消化，还可以促进外伤愈合，缓解因蚊虫叮咬而发生的瘙痒疼痛的感觉；在工业行业中，用于皮革脱毛、蚕茧脱胶、明胶制造等。

1.2.2菠萝蛋白酶

菠萝蛋白酶是一种植物蛋白酶，由菠萝汁、皮等提取的巯基蛋白酶。在食品加工业中，可以用于焙烤食品，降解生面团中的面筋，提高饼干与面包的口感和品质；用于肉制品的精加工，水解肌肉蛋白，嫩化肉质；在医药行业，用于防治心血管疾病，治疗炎症和水肿，还可用于烧伤脱痂，新皮移植，增进药物吸收；在美容化妆品行业，菠萝蛋白酶可添加于护肤品中，美白祛斑嫩肤；在饲料中，能够将饲料中的蛋白质转化成易于动物吸收的多肽和小肽，大大提高蛋白质的利用率和转化率，降低饲料成本，也能减轻养殖对环境的污染。菠萝蛋白酶也可一定程度上治疗致病菌引起的腹泻，避免抗生素的负面影响，使动物身体健康，抵御寄生虫的伤害。菠萝蛋白酶是一种理想的抗生素替代型饲料添加剂。

1.2.3中性蛋白酶

中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌代谢所得，可高效水解多种动植物蛋白。在食品加工行业中，水解蛋白质为小分子氨基酸及肽，用于生产高级调味品和食品营养强化剂及一些功能食品；也可水解面筋蛋白，是面团具有良好的延伸性和可塑性，提高烘焙成品品质；同样可用于啤酒抗寒；医药行业中，添加中性蛋白酶可以帮助消除炎症，缓解疼痛，帮助消化；纺织工业中，用于皮革脱毛，脱毛均匀干净同时可保持皮革品质；饲料工业中，水解饲料中蛋白质，促进吸收，提高饲料的利用率，降低饲料成本。

1.3蛋白酶高产菌株介绍

目前，一般从细菌中筛选可以产蛋白酶的菌株，已知的产胞外蛋白酶的细菌有很多种类^[6]，常见的有芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Aeruginosa）等。目前已发现的应用于商业化生产的产蛋白酶菌株来源不多，目前蛋白酶制剂研究的热点之一就是筛选可以产蛋白酶的新菌株，如Shanka等^[7]报道一株新的Beauveria sp.菌产生一种碱性蛋白酶，Hadda等^[8]通过对B.mojavensis A21 菌的发酵发现其可以产生两种新的碱性蛋白酶^[9]。下面介绍一些国内已报道的蛋白酶高产菌株，见表1-1

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