论文总字数：16673字

摘 要

食品安全问题日益突出，食品检测技术快速发展，传统的分析检测方法存在成本高昂、操作难度大、检测周期长、样品前处理复杂等缺点。肠毒素常见于肉、乳及其制品中，可通过多种途径污染食品，对食品安全以及人体健康都有极大的危害。本文论述了基于花朵状核酸纳米结构的电化学检测方法来检测肠毒素，该方法操作简便、检测周期短、灵敏度高、成本低。该方法利用电化学DNA传感器进行基因检测，设计一段寡核苷酸序列作为探针，并且这段探针能够专一地与所监测的特定核酸序列进行杂交，释放出SEB。通过滴加六氨合钌等电化学活性物质来放大电信号，由于电信号的强弱与SEB的量成比例关系，所以可以通过电化学检测站检测到的电信号的强弱来对SEB进行识别和定量检测。本文将传统食品检测方法与该方法进行了对比，对方法的灵敏度、选择性进行了验证，并对本方法的应用前景进行了展望。

关键词：核苷酸 电化学检测肠毒素金电极食品

Flower like nucleic acid nanostructures for electrochemical detection of enterotoxin

Abstract

The problem of food safety is becoming more and more prominent andfood testing technology has developed rapidly.The traditional methods of analysis and detection has many disadvantages, such as high cost, difficult operation, long detection cycle and complex sample pretreatment.Enterotoxin is commonly found in meat, milk and its products. It can pollute food through many ways, and has great harm to food safety and human health. This paper describes an electrochemical detection method based on the flower-like nucleic acid nanostructure for the detection of enterotoxin. This method is simple in operation, short in detection cycle, high in sensitivity and low in cost. This method uses an electrochemical DNA sensor for gene detection and designs a sequence of oligonucleotides as a probe, and this probe can specifically hybridize with the specific nucleic acid sequence monitored and release SEB.By addinghexaammineruthenium(Ⅲ) chloride and other electrochemically active substances, the electrical signals are amplified. Because the strength of the electrical signals is proportional to the amount of SEB, the SEB can be identified and quantified by the strength of the electrical signals detected by the electrochemical detection station. In this paper, the traditional food detection method is compared with the method, and the sensitivity and selectivity of the method are verified, and the prospect of the application of this method is also prospected.

Keywords：DNA; electrochemical detection; enterotoxin; gold electrode; food

目录

摘要…………………………………………………………………………………………I

Abstract………………………………………………………………………………………II

目录…………………………………………………………………………………………III

第一章文献综述……………………………………………………………………………1

1.1引言………………………………………………………………………………………1

1.2金黄色葡萄球菌…………………………………………………………………………1

1.3金黄色葡萄球菌肠毒素…………………………………………………………………2

1.4肠毒素的作用机理………………………………………………………………………2

1.5肠毒素的检测方法………………………………………………………………………2

1.5.1肠毒素的免疫学检测……………………………………………………………3

1.5.2肠毒素的分子生物学的检测方法………………………………………………3

1.5.3电化学检测………………………………………………………………………4

1.6核酸适配体………………………………………………………………………………5

1.6.1核酸适配体的定义………………………………………………………………5

1.6.2核酸适配体的特点………………………………………………………………5

1.6.3核酸适配体的应用………………………………………………………………6

第二章实验内容……………………………………………………………………………7

2.1实验原理…………………………………………………………………………………7

2.2实验材料和方法…………………………………………………………………………8

2.2.1实验设备和仪器…………………………………………………………………8

2.2.2实验试剂与材料…………………………………………………………………8

2.2.3实验方法…………………………………………………………………………9

2.3实验结果……………………………………………………………………………… 11

2.4实验方法的选择性……………………………………………………………………12

2.5实际样品实验比较分析………………………………………………………………12

第三章结论与展望………………………………………………………………………14

3.1实验结论………………………………………………………………………………14

3.2展望……………………………………………………………………………………14

参考文献……………………………………………………………………………………15

致谢……………………………………………………………………………………………18

第一章 文献综述

1.1引言

食品对于人类的生存与发展起着至关重要的重要，近年来我国食品安全问题频发，食品安全问题日益受到人们的广泛关注。因此，食品检测技术和方法也取得了广泛的关注，出现了越来越多有效可行的检测方法。肠毒素广泛的存在于多种食品中，极有必要对其进行检测。目前传统的用于检测肠毒素的食品安全检测方法主要有：酶联免疫分析法（ELISA）、多聚酶链式反应（PCR）、基因芯片技术、化学发光酶联免疫检测法（CLEIA）等。电化学传感器因其优点众多，能弥补传统方法的不足，在食品安全检测、食品成分分析、临床医药学诊断、环境质量安全监测等各个领域都有极大的应用。结合多种材料和方法能够改善电化学生物传感器的各项性能，放大电信号，检测肠毒素。本文简要介绍了基于花朵状核酸纳米结构的电化学检测方法用于检测肠毒素。

1.2金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性球菌^[1]。金黄色葡萄球菌很容易适应周边环境，能够在极其恶劣的条件中得以生存，因而广泛的存在于自然界中。许多菌株能够分泌细胞毒素或者产生毒性蛋白，这些毒性物质可以引起人体的不适，影响人体的安全和健康^[2]。金黄色葡萄球菌可以通过食品原料、生产人员、水源等多种渠道进入食品及其生产过程中，从而污染食品，感染食品并使之腐败变质，它是引起细菌性食物中毒的一种重要的病原菌。

1.3金黄色葡萄球菌肠毒素

多种葡萄球菌都能产生肠毒素，危害人体健康。肠毒素能溶于水且耐高温，因而食品经过加工后也不能将其灭活，并且经过人体消化系统也不会被消化^[3]。由于肠毒素具有很强的耐热性和耐酸性，所以加热蒸煮受污染的食物并不能使肠毒素完全变性，且这些高温加热后的葡萄球菌肠毒素仍具有超抗原活性，以引起人体的不适甚至是炎症，严重的将导致因食物中毒而引起脱水死亡。食物中往往存在多种有害物质，葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）更是其中的关键致病菌，通过对其血清特征的观察与研究可分成五大类^[4]。SEA和SEB因为其特殊性而被称作超抗原，它们能与MHCⅡ类分子结合并作用于抗原呈递细胞和刺激T细胞大群体共享可变区的T细胞受体β链^[5]。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌部分菌型等细菌均可产生肠毒素^[6]。

1.4肠毒素的作用机理

葡萄球菌肠毒素导致的食源性疾病主要由食用被肠毒素污染的食物而造成且发病率高。最初产品原料污染源杀菌消毒不足或者工厂生产人员携带且在处理制备过程中发生污染都将导致食品含有葡萄球菌肠毒素。当食品的存放温度在37℃以内时，温度越高越容易产生肠毒素。当食品的存放场所通风不良的情况下易产生肠毒素。蛋白质含量高，含水量大且含有一定量淀粉的食品更易产生肠毒素，通过食用含有葡萄球菌的食物，人体的中枢神经系统会因摄入葡萄球菌以及肠毒素产生强烈的刺激，麻痹人的神经，从而引起人体的中毒反应，较轻的症状为呕吐腹泻，严重者可能因脱水而死亡^[7]，这引起了人们的重视，并在此基础上建立了一系列的检测方法，以期能够快速有效地检测出肠毒素。

1.5肠毒素的检测方法

肠毒素在食品中十分常见，污染食品的途径众多，对于肠毒素的检测必不可少，现有的检测方法有很多，既有传统的微生物分离培养，也有分子生物学检测、免疫学检测和电化学检测方法^[8]。

1.5.1肠毒素的免疫学检测

肠毒素的免疫学检测方法众多，主要包括酶联免疫分析法(ELISA)、电化学免疫法、免疫胶体金技术。酶联免疫法的工作原理是建立在抗原体特异性结合的基础上，让固相SEB和游离相SEB共同和一定量的SEB特异性抗体进行竞争性的结合，从而洗脱游离相，再加入标记酶来让底物显示出颜色，通过颜色的深与浅来判定游离相的量，即颜色越深，量越少，颜色越浅，量越多^[9]。因此，可基于这个比例关系对待检测样品中的SEB进行定性和定量分析。酶联免疫分析法有着诸多优点，主要是方便快捷、灵敏、专一且操作简单。然而缺点是传统的双抗体夹心ELISA方法检测肠毒素需要置备两种不同来源的抗血清，并且需要纯化、标酶等步骤，操作过程缓慢，制备过程复杂且稳定性易受影响^[10]。

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