共轭亚油酸与必需脂肪酸预防牛乳腺上皮细胞氧化应激的比较

原文作者 L. Basiricograve;,^* P. Morera,^* D. Dipasquale,^* A. Trouml;scher, and U. Bernabucci^*1

单位 由FASS和Elsevier公司代表美国乳制品科学协会出版

摘要：一些体外和体内研究表明共轭亚油酸（CLA）异构体对氧化应激和脂质过氧化具有保护作用。然而，只有少数几个相互矛盾的研究表明必需脂肪酸的抗氧化能力。这项研究的目的是通过体外实验比较CLA与其他必需脂肪酸对牛乳腺上皮细胞（BME-UV1）硫醇氧化还原状态的影响和其对乳腺氧化损伤的保护作用。BME-UV1细胞用含50umol/L的顺-9,反-11共轭亚油酸、反-10,顺-12共轭亚油酸、alpha;-亚麻酸、gamma;-亚麻酸和亚油酸的完全培养基处理。通过添加脂肪酸（FA）48h后测定谷胱甘肽（GSH）、还原型辅酶Ⅱ和gamma;-谷氨酰半胱氨酸连接酶活性，评价细胞抗氧化反应。在补充了FA的细胞中，也评估了细胞内活性氧的种类和丙二醛的产生。我们评估了H₂O₂暴露3小时后活性氧种类的产生，并比较了不同FA对H₂O₂诱导的氧化应激的潜在保护作用。所有脂肪酸诱导细胞内谷胱甘肽治疗增加,伴随着高浓度的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和gamma;-谷氨酰半胱氨酸连接酶活动的增加，补充FA的细胞显示细胞内丙二醛水平降低，特别是CLA同分异构体和补充亚油酸对H₂O₂诱导的氧化损伤的抗氧化细胞反应比其他FA更好。

关键词：共轭亚油酸，必需脂肪酸酸，氧化状态，牛乳腺细胞

1. 介绍

众所周知，膳食脂肪中所含的脂类是一种极好的能量来源，20世纪前25年进行的研究表明，它们对生长和正常生理功能是必要的（Spector and Kim, 2015）。近年来，功能脂肪酸如长链n-3、n-6脂肪酸和共轭亚油酸在细胞中的生物学作用引起了人们对其健康特性的关注（Bauman and Lock,2006;Lunn and Theobald,2006）。Omega-6和n-3脂肪酸被认为是必需的脂肪酸，因为哺乳动物不能合成它们，必须从食物中获取。必需脂肪酸是所有细胞膜的重要组成部分，赋予细胞膜流动性，从而决定和影响膜结合酶和受体的行为(Das,2006)。n-6脂肪酸中，亚油酸（LA;18:2 n-6）是最常见的n-6不饱和脂肪酸,而alpha;-亚油酸（alpha;-LA），属顺式n-3 不饱和脂肪酸,是最普遍的n-3脂肪酸。亚油酸通常存在于自然界除了椰子、可可和棕榈树大多数植物的种子。另一方面，alpha;-亚油酸是存在绿叶蔬菜的叶绿体中，也存在于亚麻、油菜、辣椒、紫苏和核桃的种子中（Lunn and Theobald,2006;Si-mopoulos, 2008）。n-3和n-6脂肪酸家族就是从这两种母体脂肪酸中通过一系列酶催化的去饱和和延伸反应而产生的，这些反应通常发生在细胞浆或线粒体中。二十碳五烯酸 (EPA;20:5 n-3)、二十二碳五烯酸 （22:5 n-3）和二十二碳六烯酸（22:6 n-3）由alpha;-亚油酸代谢而来，而LnA通过gamma;-亚麻酸（gLnA；18:3 n-6）或二十碳二烯酸（20:2 n-6）代谢为花生四烯酸（ArA; 20:4 n-6），因为有两个途径是活跃的（Lunn and Theobald, 2006）。LA的衍生物花生四烯酸可以转化为2-系列的血栓素和4-系列的白介素。这两种物质是非常重要的、活跃的、活性时间短的二十烷酸激素，它们参与了与炎症有关的各种病理生理过程，如动脉粥样硬化、肥胖和炎症性肠病。相反，alpha;-LA衍生物，如EPA，产生了一组完全不同的类二十碳烷，与花生四烯酸衍生的类二十烷类药物相比，这些3-系列的前列腺素和凝血酶和5-系列的白介素，它们被认为炎症性更低，甚至有抗炎症作用（Patterson et al.,2012）。

在奶牛中，已经观察到饮食补充亚油酸和alpha;-亚油酸可以作为一种营养策略来提高泌乳奶牛的繁殖性能和增加妊娠率（Diran-deh et al.,2013）。这是因为EFA可以刺激卵泡生长和类固醇的产生(Leroy et al.,2013)。此外，亚油酸和alpha;-亚油酸能够调节奶牛的炎症反应和免疫反应(Lessard et al.,2003；Caldari-Torres et al.,2011)。

共轭亚油酸是亚油酸的一组构象和构象异构体，在瘤胃生物加氢过程中形成，随后由瘤胃酸内源性合成（Schmid et al.,2006; Bauman et al.,2008），其中具有反式构象双键的异构体具有生物活性。研究最多的生物活性共轭亚油酸是顺-9、反-11异构体和反-10、顺-12异构体。CLA在健康方面的作用已经在动物和人类中进行了研究（Pires and Grummer 2008;Mele et al.,2013）。据观察，共轭亚油酸可能在癌症、心血管疾病、肥胖、骨质疏松症以及免疫和炎症反应中发挥重要的保护作用（Benjamin and Spener, 2009;Moraes et al.,2012;Oliveira et al.,2012;Du et al.,2014）。

反刍动物已经进化到以新鲜的草和树叶为食。根据他们的饲料偏好，霍夫曼和斯图特尔将他们分为精料选择者、中间混合饲料者、或草料和粗饲料采食者。奶牛属于食草类或粗饲料类动物，如Bos primigenius（欧洲野牛），以牧草和干草为食。现代的TMR饮食与奶牛的自然饮食有很大的不同（例如，其瘤胃CLA的合成）。Elg-ersma等人(2004)研究表明，当饮食改变为更现代的青贮饲料或精料TMR类型时，与以新鲜草为食的奶牛产的牛奶相比CLA含量迅速下降。在一篇综述中，Elgersma等人（2006）总结道，一般来说，鲜草(如牧场)上的奶牛产的牛奶中共轭亚油酸水平明显较高。观察到的牛奶中共轭亚油酸含量的差异引发了对TMR喂养的奶牛牛奶中共轭亚油酸含量增加的广泛研究，这些研究主要考虑的是人类健康。很少把CLA作为奶牛的一种营养物质和健康放在第一位（Elgersma et al.,2004, 2006）。对家畜的研究表明，某些共轭亚油酸同分异构体可降低乳牛的乳脂合成，从而改善奶牛的能量平衡，减少能量需求。这是常规观察到的CLA能降低乳脂百分比，增加产奶量，改善泌乳早期的繁殖能力，减少泌乳早期代谢紊乱(酮症)的发生率，减少围生期炎症过程的负面影响（Bauman et al.,2008;Galamb等，2016）。一些研究表明CLA同分异构体在动物模型中对氧化应激和脂质过氧化具有保护作用（Andreoli等，2010;Chinnadurai等，2013）。Gessner等人(2015)在奶牛和乳用母羊中发现，Zeitz等人(2015)在添加了CLA的动物的牛奶中显著提高了维生素E和A的浓度。氧化代谢的变化发生在奶牛的过渡时期，多项研究表明，氧化应激增加了奶牛对疾病的易感性（Bernabucci et al.,2005;Castillo et al.,2005;Sordillo and Aitken, 2009）。然而，关于补充抗氧化剂(维生素和微量元素)对奶牛健康和性能的影响，结果并不一致，因为在大多数情况下，动物的抗氧化潜力没有事先评估，也没有相应的营养策略规划（Abuelo et al.,2015）。因此，我们最近的研究（Basirico et al.,2015）表明CLA同分异构体在牛乳腺细胞中具有显著的高氧化还原状态，具有抗氧化作用。关于alpha;-LA、LA和g-LA的保护潜力，只发表了一些相互矛盾的报告（Arab et al.,2006b）。Fagali和Catala(2008)在一项体外研究中证明CLA表现出比LA或alpha;-LA更强的消灭自由基作用。因此，本研究的目的是通过牛乳腺上皮细胞体外模型（BME-UV1）比较CLA与其他EFA方法对细胞硫醇氧化还原状态及其对乳腺氧化损伤的保护活性的影响。

1. 材料和方法
2. BME-UV1培养条件

BME-UV1细胞系是佛蒙特大学通过稳定转染SV40大T抗原从牛乳腺上皮细胞原代培养中获得的;BME-UV1细胞由Antonella Baldi （意大利米兰大学FENS系）提供。细胞常规培养到75-cm²组织培养瓶 （Costar, Corning, NY）中，用50% DMEM-12，30% RPMI-1640，20% NCTC-135的混合物（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州），补充10%胎牛血清，0.1%乳糖0.1%水解乳白蛋白，谷胱甘肽1.2mM，1mu;g /ml的胰岛素，转铁蛋白5mu;g /ml，1mu;g /ml的氢化可的松，0.5mu;g /ml的孕酮，10mu;g /ml l-抗坏血酸，和抗生素（青霉素100IU/ml;链霉素100mu;g /ml）。所有补充培养基均来自西格玛-奥尔德里奇。细胞在5%二氧化碳和37℃的培养箱中培养。本实验所用细胞传代数在39 ~ 41之间。

1. 实验设计

研究脂肪酸对牛乳腺的代谢和氧化状态的BME-UV1细胞重新悬浮在完全培养基中,培养24小时后,丢弃原培养液，分别用含50mu;M cis-9, trans-11 CLA,trans-10,cis-12 CLA, aLnA （18:3n-3)）gLnA （18:3n-6）和LnA（18:2n-6）的完全培养基处理48h，对照组细胞不加脂肪酸。实验前首先将必需脂肪酸溶于95%乙醇，再用储备液稀释制成缓冲液（培养基）。为了确保有机溶剂的残留量不很小，因为有机溶剂在低浓度下可能有生理效应，我们进行了细胞活力的控制试验，没有观察到细胞毒性作用或生物学差异(数据未显示)。

为检测FA对H₂O₂诱导的氧化应激的潜在保护作用，用H₂O₂（50mu;M）处理细胞，37℃孵育3h同时测定了活性氧(ROS)和丙二醛（MDA）的含量。测定添加FA 48h后的细胞存活率。单次FA作用48h后，细胞内的活性氧含量和MDA的含量均有不同程度的变化。检测的脂肪酸购自瑞典拉罗丹。实验包括每次处理至少3次重复，并至少重复两次。

1. 细胞抗氧化反应与细胞保护

细胞活力测定。用细胞增殖试剂盒II 分析XTT[XTT:钠30-[1-(苯基氨基羰基)-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸水合物，罗氏应用科学，印第安纳波利斯，印第安纳州]根据制造商的说明。测定与FA孵育48小时后的细胞存活率（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸水合物; 简单地说，细胞以最佳密度（5times;105cells/mL）接种到96孔的微孔板中，并在如前所说的相同条件下培养。经过48小时培养后，每孔加50micro;L标记过的 XTT。37℃孵育24小时后，在450 nm处测定吸光度。

外文文献出处：乳品科学.100:2299-2309 https://doi.org/10.3168/jds.2016-11729由FASS和Elsevier公司代表美国乳制品科学协会出版

附外文文献原文：

ABSTRACT

Some in vitro and in vivo studies have demonstrated protective effects of conjugated linoleic acid (CLA) isomers against oxidative stress and lipid peroxidation. However, only a few and conflicting studies have been conducted showing the antioxidant potential of essential fatty acids. The objectives of the study were to compare the effects of CLA to other essential fatty acids on the thiol redox status of bovine mammary epithelia cells (BME-UV1) and their protective role against oxidative damage on the mammary gland by an in vitro study. The BME-UV1 cells were treated with complete medium containing 50 micro;M of cis-9,trans-11 CLA, trans-10,cis-12 CLA, alpha;-linolenic acid, gamma;-linolenic acid, and linoleic acid. To assess the cellular antioxidant response, glutathione, NADPH, and gamma;-glutamyl-cysteine ligase activity were measured 48 h after addition of fatty acids (FA). Intracellular reactive oxygen species and malondialdehyde production were also assessed in cells supplemented with FA.

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 11 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[275365]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word