响应面法优化微波辅助提取罗勒中的多酚类化合物

原文作者 Snežana Filip, Branimir Pavlić, Senka Vidović, Jelena Vladić, Zoran Zeković

单位 诺维萨德大学技术学院生物技术与制药工程系

摘要：

通过响应面法优化了微波辅助萃取（MAE），以提高罗勒Ocimum basilicum L）中多酚类化合物的提取效率。运用Box–Behnken在三水平三因素上进行的实验设计进行了优化。考察乙醇浓度(50、70和90%)；微波功率(400,600和800 W)；各响应的提取时间(15、25、35 min)的影响。将实验结果拟合到二阶多项式模型中，并使用多元回归分析和方差分析来评估模型的适用性和最佳条件。考虑到提取的总酚，总类黄酮的最大含量和抗氧化活性，研究响应的最佳条件是乙醇浓度为50％，微波功率为442 W，提取时间为15 min。在最佳条件下，得到的罗汉国液体提取物包含4.299 g没食子酸当量/ 100 g干重（DW）的总多酚，0.849 g儿茶素当量/ 100 g DW的总黄酮，IC₅₀和EC₅₀值为分别为9.602和82.889 mu;g/ mL。同时利用MAE研究提取罗勒中总酚，总黄酮和潜在的抗氧化剂的方法的开发，表明罗勒是有价值的生物活性物质来源。

关键词：罗勒（Ocimum basilicum L）; 多酚; 黄酮类化合物; 抗氧化活性; 响应面法

1、内容

食品工业对使用抗氧化剂或富含抗氧化剂的食品作为食品防腐剂或营养补充剂很感兴趣（Gil-Chavez等，2013）。如今，人们非常关注天然抗氧化剂或富含抗氧化剂的草药提取物，它们来自植物，特别是芳香草药和香料。罗勒（Ocimum basilicum L.）属于唇形科，高度芳香，味道宜人，主要用于烹饪。它原产于亚洲，非洲，南美和地中海，但在许多国家广泛种植。罗勒对精油（EO）生产具有重要的经济意义。通过蒸汽蒸馏从叶和花冠上提取的罗勒的EO用于调味食品、牙科和口腔用产品、香料和药品（Simon等，1999）。 罗勒精油具有抗病毒（Sanchez等，2010）、抗菌（Carocho等，2016; Nebedum等，2009; Nguefack等，2004）、消炎、杀虫（Keita等，2000; Umeria等，1998）和抗氧化活性（Filip等，2016; Pripdeevech等，2010）的作用。众所周知，罗勒是多酚类化合物和类黄酮的丰富来源，如肉桂酸、咖啡酸、迷迭香酸、癸二酸、槲皮素、山梨醇等（Grayer等，2002; Javanmardi等，2002; Jayasingheet等，2003; Lee和Scagel 2009; Tada 等，1996）。此外，它的酚类化合物和类黄酮还被证明是强大的抗氧化剂，自由基清除剂和金属螯合剂（Flanigan and Niemeyer 2014; Jayasinghe等， 2003; Pietta 2000）。此外，植物化学物质例如植物中的酚类化合物由于其有益健康的抗氧化性能以及对炎症、心血管疾病和某些类型的癌症的可能的保护而备受关注。

可以通过不同的提取技术从天然植物中提取作为抗氧化剂化合物和抗氧化剂活性的载体。传统的萃取技术包括浸渍、渗滤、索氏萃取和浸泡，存在某些缺点，例如萃取时间长，溶剂量和加热量大，并且对不耐热的活性化合物有热降解的危险。因此，已经引入和研究了各种新颖的提取技术，其中大多数被认为是效率、溶剂消耗和提取时间的最佳中间条件。可用的新技术是微波辅助萃取（MAE）、超声辅助萃取（UAE）、超临界流体萃取（SFE）和加压溶剂萃取（PSE）。由于MAE具有特殊的加热机制，适中的投资成本以及在大气条件下的良好性能，MAE已在各个领域引起了广泛的研究关注，尤其是药用植物研究（Chan等人2011; Fillyetal.2014; Veggietal.2013）。微波由在0.3至300 GHz频率范围内振荡的电磁场组成。微波会渗透到草药材料中并与极性化合物相互作用，从而产生热量。微波能量的加热通过离子传导和偶极子旋转直接作用于分子（Zhang等人，2011）。基于这些原理，可以通过微波萃取以多种比例萃取具有高和低偶极矩的化合物。

考虑到提取物收率或目标化合物的最大化，相对于提取物的质量，微波功率和提取时间的优化以及其他潜在的操作参数通常是通过响应面方法（RSM）进行的。通过常规和非常规提取技术，该方法已用于优化从多种植物材料中提取多酚的工艺。 RSM是一种用于过程优化的常用方法，其中逐一研究自变量对响应的影响，而所有其他因素均保持恒定值（Baş和Boyacı2007）。这种实验方法结合了数学和统计技术，可用于开发、改进和优化过程。通过分析自变量对响应变量的影响，该实验方法可以生成数学模型，该数学模型可以描述所研究的实验过程。

迄今为止，微波处理已被广泛用于从不同植物材料中提取总酚类化合物（Bouras等人2015; Milutinović等人2014; Simić等人2016; Zeković等人2016）。据我们所知，MAE对从罗勒中提取多酚的影响尚未见报道。这项研究的目的是采用RSM评估乙醇浓度（50-90％）、MAE的照射功率（400-800 W）和提取时间（15-35分钟）的不同组合对乙醇的影响，从而得到由MAE获得的罗勒液体提取物的总酚含量（TP），总类黄酮含量（TF）和抗氧化活性。为此，考虑到难以获得具有特定化合物的天然植物提取物的困难，本研究旨在成为开发罗勒提取工艺的有用工程工具。

2、材料和方法

2.1 植物材料

罗勒（Basil）是2013年在 塞尔维亚BačkiPetrovac的替代作物系诺维萨德（Novi Sad）田地和蔬菜作物研究所培育的。风干并在室温下储存收集的植物材料（叶和花顶），干罗勒是在家用搅拌机里捣碎的，用筛网组(CISA,Cedaceria Industrial,Spain)测定材料的粒径(0.363mm)。使用标准程序分析罗勒的水分含量（10.824％），即通过将植物样品在105℃干燥至恒重进行分析。该分析进行了三次重复。

2.2 化学试剂

Folin-Ciocalteu试剂，（plusmn;）-儿茶素和1,1-二苯基-2picryl-肼基水合物（DPPH）购自Sigma（Sigma-Aldrich GmbH，Steinheim，Germany）。没食子酸购自西格玛公司（美国密苏里州圣路易斯）。使用的所有其他化学药品均为分析纯。

2.3 MAE过程

单模微波辅助萃取（MAE）在自制设备中进行，该设备由微波炉（NN-E201W，日本松下）和带有圆瓶和冷凝器的合适玻璃仪器组成（Zeković等人，2016年）。 在不同的提取时间，乙醇浓度和辐照功率下进行了17次MAE实验运行。在每个实验运行中，将5.0 g样品与50 mL萃取溶剂混合在500 mL圆瓶中。然后将烧瓶置于MAE设备中，并以固定频率进行提取。 烧瓶始终与磁控管放置在相同的距离上，并且不进行额外的搅拌。 提取后，将粗提取物在真空下立即通过滤纸（孔径为4至12 mu;m，Schleicher和Schuell，德国）过滤。 将提取物收集到玻璃烧瓶中，并保存在4℃直至进一步分析。

2.4 变量筛选

大量的参数会对所研究的萃取系统产生影响，因此选取那些影响较大的参数是非常重要的。可能影响MAE的因素包括溶剂性质、溶剂与固体的比例、萃取时间、微波功率、温度、样品特性、萃取周期等。了解这些因素对MAE过程的影响和相互作用非常重要。

作为初始步骤，选择最合适的溶剂。有许多报道表明，乙醇是从草药中提取各种多酚化合物的最合适溶剂（Do等人，2014年;Zekovićetal.2014年）。根据以前由Vidović等人报道的，通过浸渍制备的罗勒提取物中总酚，类黄酮和抗氧化剂活性来选择乙醇浓度（2012）。 MAE的条件范围的选择是基于文献数据（Zeković等人，2016年）。微波功率的影响在400至800 W的范围内，提取时间在15至35分钟的范围内。表1列出了分析的详细信息。

2.5 酚类总含量

使用Folin-Ciocalteu程序（Kauml;hkouml;nen等，1999； Singleton和Rossi 1965）测定所得罗勒液体提取物中的总酚含量（TP）。没食子酸用作制备标准曲线的标准品 ，并在750nm（6300分光光度计，Jenway，英国）上测量样品的吸光度。 酚类化合物的含量以每100克干重（DW）的没食子酸当量（GAE）克数表示。一式三份地准备所有实验，并且结果表示为平均值。

2.6 总黄酮含量

总黄酮含量（TF）使用氯化铝比色法（Harborne 1984）测定。 儿茶素用于制备标准曲线，并在510 nm下测量吸光度。结果表示为每100 g DW儿茶素当量（CE）的克数。一式三份地准备所有实验，并且结果表示为平均值。

2.7 抗氧化剂测定-DPPH测试

如Espinetal.2000所述，使用简单，快速的分光光度法测定罗勒提取物的自由基清除活性。将制备的提取物与甲醇（96％）和90mu;M2,2-二苯基-1picryl-肼基（DPPH）混合给出不同的最终浓度。 在室温下60分钟后，在515 nm下测量样品的吸光度。 自由基清除能力（％RSC）通过以下公式计算：

%RSC=100minus;( A_样品times;100)/A_空白

其中A_样品是样品溶液的吸光度，A_空白是对照溶液的吸光度。 抗氧化活性也表示为IC₅₀，代表获得50％的自由基清除能力所需的测试浓度（提取液），以微克/毫升表示。一式三份地准备所有实验，并且结果表示为平均值。

2.8 降低功率测定

样品的还原能力是根据测定方法确定的，该方法基于多酚抗氧化剂对Fe ³ 的还原作用，该方法先前由Oyaizu（1986）描述。 将不同稀释度的液体提取物（1 mL）与磷酸盐缓冲液（1 mL，0.2 M，pH 6.6）和1％铁氰化钾（1 mL）在玻璃管中混合。 将试管在50℃温浴20分钟。 温浴后，将10％三氯乙酸溶液（1mL）加入到反应混合物中。 然后将试管以3000 rpm离心10分钟，并将上清液（2 mL）与双蒸馏水（2 mL）和0.1％FeCl₃溶液（0.4 mL）进一步混合。在700nm处测量吸光度。 通过使用适当的萃取溶剂代替样品来制备空白探针。 EC₅₀值（mu;g/ mL）进一步表达了抗氧化活性，使反应混合物中的Fe³ 离子减少了50％。一式三份地准备所有实验，并且结果表示为平均值。

2.9 实验设计与统计分析

RSM用于研究提取参数的影响并优化了各种响应的条件。具有三个变量（Box和Behnken 1960）的Box-Behnken设计（BBD）用于确定响应模式并建立模型。完整设计以随机顺序进行，由17种组合组成，包括在中心点重复5次。本研究中使用的三个独立变量为乙醇浓度（X₁，50–90％）；提取时间（X₂，15–35分钟）；和辐射功率（X₃，400–800 W）。为了规范化参数，每个编码变量都被迫在-1到1的范围内，以使它们都更均匀地影响响应，因此参数的单位无关紧要（Baş和Boyacı2007）。根据以下等式对变量进行编码（Wang等，2013）：

X=( X_i－X₀)/Delta;X 1).

其中X是编码值，X_i是对应的实际值，X₀是域中心的实际值，并且Delta;X对应于X的1单位变化的X_i的增量。BBD的实验因子及其水平的编码值 如表1所示。

将响应变量拟合到以下二阶多项式模型（等式（2）），该模型通常能够描述响应与自变量之间的关系：

X_i和X_j是影响响应的自变量; beta;₀，beta;_i，beta;_ii和beta;_ij分别是拦截项，线性项，二次项和交互项的回归系数。

获得了针对四种不同响应（TP，TF，自由基清除活性和还原能力）的最佳提取参数。多重反应的治疗和最佳条件的选择基于合意函数D（Derringer1980; Myers et al.2009）。实验设计和多元线性回归分析使用Design-Expert v.7 Trial（Stat-Ease，美国明尼苏达州明尼阿波利斯）进行。通过方差分析（ANOVA）以0.05的显着性水平对结果进行统计学检验。通过确定系数（R²），方差系数（CV）和模型的p值以及缺乏拟合检验来

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