摘要

应用超声波辅助提取技术从扎格罗斯橡树（Quercus brantii Lindl）中提取多糖。研究四个独立因素的影响，超声波功率（X1：150–300 W），提取温度（X2：50–90◦C），提取时间（X3：30–90 分钟）以及水与原料的比例材料（X4：15–45））对提取率的影响，使用响应面方法优化了从（QBLP）叶片中提取多糖的产量。将获得的实验数据拟合到二阶多项式方程。QBLP 的最佳提取条件确定如下：X1：205.8 W，X2：81.9◦C，X3：55.6 分钟，X4：23.4。在最佳提取条件下，实验产率为 19.42plusmn;0.53％，与模型预测的值 19.61％完全匹配。结果表明，多糖对 DPPH 和羟基自由基具有很强的清除活性。此外，QBLP 在 1.5–2.5 mg/mL 时显示出良好的抗菌活性。

1. 介绍

多种萃取技术已经被应用于从从植物材料中分离有价值的化合物。通常，多糖是通过加热提取来提取的。目前，从天然植物中提取多糖的新技术已经被开发出来。与其他先进的提取方法如超临界流体提取、离子对提取、酶提取和微波辅助提取相比，超声波提取速度快、成本低、操作简单。超声波处理的原理包括热和机械效应以及空化，通过一种超级搅拌极大地促进了不混溶相之间的质量传递。

栎，俗称橡树，属于栎科。它被认为是一种能很好地适应干燥和低温气候的物种，发现于伊朗的地中海-橡树林。橡树有螺旋状排列的叶子，在许多物种中有裂片边缘。据报道，白藜芦醇提取物具有很强的保肝、抗肿瘤和抗衰老活性，可能与其成分的抗氧化能力和对CYP2E1表达的影响有关。同时还报道称，口服或局部给药后，它还具有抗炎症活性。

多糖是一种聚合的碳水化合物分子，可以在适当的条件下提取。从大量植物中分离出的多糖广泛应用于于食品加工，如:增稠剂或胶凝剂；乳液和分散体的稳定剂；成膜包衣物质，保护敏感食品免受不良变化的影响；和惰性燃料，以增加饮食中不易消化的压载物质的比例。

近年来，超声波辅助提取天然植物多糖的技术得到了发展。。一些疾病，如癌症、动脉粥样硬化和类风湿，可以由氧衍生的自由基(·OH)直接诱发，而自由基清除活性是生物活性化合物的重要功能特性之一。自由基清除活性和抑制区常被用来评价抗氧化和抗菌能力。。近年来的研究表明，许多植物多糖具有很强的抗氧化活性，应引起重视

响应面法是经验和数学技术的集合，用于评估多个参数 之间的相互作用并优化过程。这个程序减少了实验试验的次数和总费用。

就我们所知，在文献中没有关于通过响应面法优化从Q.brantii中超声辅助提取多糖的报道。在这项工作中，在这项工作中，首先研究了从Q.brantii中提取的多糖（QBLP）（％）的超声辅助提取变量（超声波功率，提取温度，提取时间和水与原料的比例），并对 其进行了优化。（4 个因素和 3 个水平）。通过各种体外试验研究了 QBLP 的抗氧化和抗菌活性。

1. 材料和方法

2.1材料

Q.brantii的叶子从伊朗Kermanshah省采集了，清洗、冷冻干燥和粉末进行本研究。使用的所有其他化学品和溶剂均为分析级，从德国默克公司购得。

利用超声提取法从Q.brantii的叶子中提取粗多糖。用 Pan 等人的方法从Q.brantii叶中提取多糖。首先在 60◦C 的水浴中，用 80％乙醇提取粉末， 以使内源酶失活，并去除干扰成分，包括样品中的游离糖、氨基酸和多酚。如先前所述去除蛋白质。粗多糖中的蛋白质含量按照布拉德福方法测定。低于0.8克/100克粗品(标准差= 0.03)。因此，蛋白质对实验的干扰是微不足道的。乙醇提取物离心(7000转，20℃，15分钟)。乙醇提取分别用85%乙醇和丙酮沉淀。收集提取物并冷冻干燥，然后用水洗涤，用超声波浴在50-90℃下进行超声波处理，水与原料的比例为15-45，超声波功率为150-300瓦，持续30-90分钟。QBLP用天平称重。多糖得率(%)计算如下:

为了确定超声波功率，料液比，提取时间，温度对多糖提取率的影响，在BBD实验设计中应用响应面法分析，这种设计可以在一个29个实验的表格中研究四种因素的影响。使用软件包“ Design- Expert 7.0 版”进行统计分析。定义了二次多项式模型用以适合响应。beta;₀为常数，回归系数分别表示通过多元回归分析估计的模型的线性，二次和交互作用。X1（超声波功率），X2（提取温度），X3（提取时间）和 X4（水与原料的比率）是从-1 到 1 的编码变量。

抗氧化活性

羟基自由基清除活性的测定

QBLP清除羟基自由基的活性是通过肖等人(2012)的方法测定的。多糖溶解在去离子水中，形成最终浓度为0.5，1，1.5, 2, 2.5 and 3 mg/mL。

将1毫升样品溶液与2毫升0.05毫升反应缓冲剂(pH7.4)、1.5毫升，5mM的1，10-二氮杂菲、1毫升7.5mM的四氧化二铁和1毫升0.1%氢氧化铁混合，加入试管中。在室温下反应20分钟后，在536纳米测量混合物的光吸收，维生素C作为阳性对照。羟基自由基的清除活性表达如下:

A0和1a分别为吸光度(无样本添加)和QBLP。

DPPH自由基清除活性的测定

根据onLai，Wen，Li，Wu和andLi的方法，研究了 QBLP 的DPPH 自由基清除活性。简而言之，将不同体积的具有不同浓度（0.5、1、1.5、2、2.5 和 3 mg / mL）的 QBLP 溶液添加到 2 ml DPPH 溶液中，并用 70％乙醇将最终反应体积增加至 4 mL。剧烈摇动后，将混合物在 25◦C 的黑暗环境中孵育 30 分钟。用紫外可见光谱仪在 517 nm 处测量吸光度。用合成抗氧化剂丁基化羟基甲苯（BHT）作为阳性对照重复相同的步骤。反应混合物的较低吸光度表明其具有较高的自由基清除活性。根据以下等式计算清除 DPPH 自由基的能力：

QBLP 的抗菌活性实验通过滤盘扩散板法进行了一些修改。购买细菌(伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)、酵母(白色念珠菌)和真菌(柑橘青霉菌)作为测试微生物。将每种含有106个细胞/毫升的试验生物的接种溶液(100升)添加到培养基中后，将含有样品(0.5、1、1.5、2、2.5和3毫克/毫升)的过滤器(直径5毫米，厚度1.5毫米)放置在顶部琼脂凝固后的平台中心。营养琼脂作为对照。底物平板在37℃孵育24小时，而酵母和真菌平板在28℃孵育48小时。抗菌活性用卡尺测定，用抑制区的直径(mm)表示。

2.6 .统计分析

所有数据均显示为三次平行测量的平均标准偏差，而相对标准偏差的数据则使用SAS进行分析。结果通过方差分析进行评估，p值小于0.05被认为是显著的，具有统计学意义。

结果和讨论

QBLP的提取率

超声波功率对QBLP提取率的影响

为了考察不同超声功率对QBLP提取率的影响，采用100、125、150、175、200、225、250、275和300瓦的不同功率(图1a)进行提取，提取温度，提取时间和料液比固定为70^◦C，60min，30。

如图1a所示，当超声功率为300瓦时，观察到了QBLP的最大提取率。这与其他作者在提取多糖方面的报告非常一致(Yanet等人，2011年)。尽管在300瓦时多糖的提取率也很高，但从工业化的角度来看，增加超声波功率会导致提取成本的增加。因此，100–300瓦

在本研究中被考虑。多糖扩散系数的增加和多糖在更高功率时导致在萃取溶剂中溶解度的增强使得橡树叶中流入溶液的多糖质量的增加。由于多糖溶解度的增加，提取系数随着超声功率的增加而增加。

提取温度对QBLP 提取率的影响

提取温度是影响QBLP提取率的重要因素之一，选择最佳提取温度，以保证超声波辅助提取QBLP的最大提取量是很有必要的；其他因素为:超声波功率225瓦，提取时间70分钟，料液比30。从结果中可以观察到提取率增加并在90℃达到最大值，然后下降(图1b)。在从猩猩木中提取多酚的过程中也观察到了类似的结果。因此，在本工作中研究了50–90◦C的提取温度。

提取时间对枸杞多糖提取率的影响

将不同的提取时间设定为20、30、40、50、60、70、80、90和100分钟，以评估提取时间对提取率的影响。在超声波功率225瓦，提取温度70℃和水与原料的比例30的提取条件下，结果如图(图1c)。图1表明，QBLP提取率与增加的提取时间和提取时间的增加有关，当提取时间达到90min时，提取率为17.48plusmn;0.5％，当提取时间超过 90 分钟时，产率随时间的增加而下降。这些数据表明，应用更长的提取时间可能导致 QBLP 降级。因此，本研究采用了 90 分钟的提取时间。

料液比对QBLP萃取收率的影响

研究了水与原料的比例(10、20、30、40和50)对萃取率的影响

当其他三个因素(超声波功率、提取时间和提取温度)为225瓦，60分钟和70摄氏度。图1显示了料液比对提取效率有显著影响。当提取率从10%提高到50%时，QBLP的提取率显著提高。结果表明，在40∶1的比例下，QBLP的提取率显著提高，达到18.32%。在本研究中，提取率为45%。因此，选择45作为水与原料的最佳比例。

根据单参数研究，调整超声功率为150–300瓦，提取温度为50–90℃，

响应面法实验的提取时间为30-90分钟，水与原料的比例为15-45。

3.2 .模型设定和充足性检查

使用 Box–Behnken 设计评估了四个超声辅助提取条件的影响， 包括超声功率，提取温度，提取时间和水与原料的比例对 QBLP 收率的影响（表 2）。应用二阶多项式方程建立数学模型，以找到使QBLP 提取率最大化的最佳条件，并研究自变量与响应之间的组合关系。下面给出了根据编码变量开发的二阶模型：

其中 X1 是超声功率（W），X2 提取温度（◦C），X3 提取时间（min），X4 分别是水与原料的比例和 QBLP 的 Y 产率（％）

表3总结了BBD实验结果的方差分析结果。方差分析用于确定独立变量对响应的线性、二次和交互作用的决定系数、缺失系数和影响系数。

使用表3中的数值测试了系数的重要性。随着p值变小，相应的变量变得更加有效。此外，p值可用于检查独立因素之间的相互作用强度(穆拉利达尔、奇鲁马米拉、拉马钱德兰、马尔尚和尼甘）R2_调和 R2 表示（5）分别为 0.957 和 0.978，表示实验和理论产量的相关程度更高。较低的方差系数（6.49） 清楚地表明该模型具有可重现性和可靠性，根据分析， F 值为 46.19，p 值lt;0.0001 表示响应面二次模型很重要。此外，方差分析的结果表明，拟合的不足是无关紧要的。

3.3 .QBLP提取条件的优化

独立变量通过响应面法使用BBD进行优化，以获得QBLP的最大提取率。优化的目的是确定超声波辅助提取条件，该条件给出了QBLP的最大预测产率(表4)。

在图2a中，当用不同的超声功率和提取温度在固定的提取时间60分钟和水与原料的比例为30时，当样品展开时，QBLP的提取率提高。随着超声功率和提取温度的增加，QBLP的产率明显增加。最佳提取温度分别为222摄氏度和68摄氏度。

在图2b中，绘制了在固定的提取时间70min和水与原料的比例30下，用不同的超声功率和提取时间提取QBLP的图时，可以看出，当超声功率和提取时间分别为295和60分钟时可达到QBLP的最大提取率。图2显示了在固定的提取温度70和提取时间下，超声功率和水与原料的比例对QBLP提取率的影响。

图 3d 中的曲线给出了 QBLP 的提取率在固定超声功率 225 W 时，提取温度和提取时间以及水与原料 30 的比例的关系，表明 QBLP 的提取率随着提取温度从 70◦C 增加到90◦C，提取时间的增加从 75 分钟增加到 90 分钟，提取的率增加。

图3e 显示了在不同的萃取温度下以及固定萃取时间 60 分钟和225 W 超声功率下水与原料的比率对提取率影响的图。随着水与原料之比从37增加到45，QBLP的提取率增加。在提取温度为80-9度时，QBLP的提取率迅速增加。

图3f显示了在固定提取温度和超声波功率条件下(70度，225瓦），不同提取时间的影响。可以观察到，当提取时间和水与原料的比例分别为 70 分钟和 30 时，QBLP 的提取率最高。通过期望函数法获得了 QBLP 的最大收率和最佳提取条件：超声功率为 205.8 W，提取温度为 81.9◦C，提取时间为 55.6 min，水/原料比为 23.4，模型预测最大响应为 19.61％，期望值为 0.982。

3.4 模型验证

为了验证模型方程的充分性，在优化的条件下(超声功率为205.8瓦，提取温度为81.9摄氏度，提取时间为55.6分钟，水料比为23.4)进行了六次验证实验，然后测量了响应。QBLP的提取得率为19.420.53 %(19.61)。该值非常接近相应的预计值(表4)。结果表明，该方法能有效地优化QBLP的提取条件，并表明回归模型对QBLP的提取是准确和充分的。

3.5 抗氧化能力

3.5.1羟基自由基的清除活性

羟基自由基是高毒性物种，可以通过自由基反应与大多数生物分子反应。这些自由基对生物体非常危险。因此，清除羟基自由基对细胞或食物系统的抗氧化防御非常重要。叶子中的多糖是最有希望抑制食物和免疫系统中氧化反应的抗氧化剂种类之一，因为它们来源广泛且毒性低。一些研究已经说明了从橡树中分离的多糖具有相当大的生物活性，如抗凝血和清

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