响应面法优化杨树花生松素的超声波辅助提取工艺

原文作者:盛尊来 单位：东北农业大学兽医学院

摘要:在该研究中，用超声波辅助提取法提取杨树花的生松素。基于单因素实验的结果，四个独立的参数包括乙醇（40%-80%）、提取温度（50 - 70 ℃）、提取时间（25 - 45分钟）、电声强度（40.8 - 81.5瓦/米²）。根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，采用响应面分析法进行进一步研究。将实验数据拟合到二次响应面模型中，采用多重回归分析，调整系数值R²为0.9697。在最佳条件（乙醇浓度 为68％，提取温度为67 ℃，提取时间为42min，电声强度为66.81 W /cm²）下，获得生松素的最高产率为（134.2 plusmn;1.53 mg/g）。与预测值132mg/g一致。此外，UAE与回流萃取法的比较也表明了UAE对杨树花生松素提取工艺的适用性。

关键词:生松素；超声波辅助提取；杨树花；响应面法；Box-Behnken设计

1介绍

生松素（5，7羟基氟黄酮）是一种天然的黄酮类化合物，存在于蜂胶和几种植物中，如中国松和佛菊^[1-3]。研究表明，生松素具有多种药理作用，包括抗菌、抗炎、抗菌、抗癌和神经保护作用^[4-8]。更重要的是，生松素已被用作缺血性脑卒中患者临床试验的候选物^[1]

杨树花以山茱萸的雄花序为原料，作为我国的一种传统药物。它是中国本土的，而且由于其对广泛的气候条件的耐受性而广泛分布。研究表明，杨树花含有多种抗氧化剂，如槲皮素、木犀草素、芹菜素、皮诺克卜林和金霉素^[9]。重要的是，花中的生松素含量远高于其他酚类化合物，表明杨树花可以作为一种新的资源来获得天然的生松素。然而，丰富的资源在过去被浪费，因为很少有研究涉及杨树花。因此，有必要开发一种有效的提取策略以获得具有高提取物率和高效率的生松素，以供潜在的药物应用。

传统的提取方法在制药、化妆品或食品工业中有很多缺点，包括效率低、能耗高、环境破坏等。为此，一些绿色萃取技术，如超声、微波、超临界流体萃取、酶辅助牵引或电技术等，由于其高效率、低能耗、加工步骤减少等优点，已成为研究的热点^[10]。然而，超声辅助提取（UAE）是最简单、经济最便宜的绿色提取技术之一。近年来，有一些关于UAE在各种成分和多种天然产物的提取中的应用的报道^[11,12]。超声引起的UAE的改善归因于细胞壁的破坏、颗粒尺寸的减小和空化产生的气泡塌陷引起的细胞含量向溶剂的传质的增强^[13]。因此，其提供了更高的提取率，减少提取时间和高处理容量，以及使用降低的温度和溶剂体积的优势^[14]。此外，UAE是一种简单、经济的技术。

当温度、溶剂组成、粒径、液固比、超声时间、电声强和萃取数^[16]等多种因素影响UAE过程时，响应面法（RSM）适合于优化多个参数，因为RSM给出的模式可以确定重要因素，预测最佳因子组合和最大响应^[17]。目前，RSM已被广泛用于优化活性化合物^[18,19]的提取工艺，证明它是优化提取工艺的有用工具。然而，目前还没有关于超声辅助提取法从杨树花中提取生松素的报道。

在本研究中，研究了从杨树花中提取生松素的UAE，并利用box-behnken设计结合响应面法对提取参数进行了优化。并将生松素的UAE与回流法进行了比较。本文的目的是建立杨树中的生松素的UAE的最佳条件，这可以为资源的开发和应用提供动力。

2材料与方法

2.1植物材料、标准和试剂

杨树花是毛白杨的雄性花序，从河北省安国的一家药店购买，并经吴俊凯副教授（黑龙江中医药大学，哈尔滨，中国）认证。将雄花序（0.5g）在60°C真空箱（D HG-9023a，上海杜特科学仪器有限公司）中干燥5h，然后用机械磨床粉碎。将雄花序粉分别按粒径分为6组，分别用2、0.85、0.36、0.25、0.18和0.15mm筛（华康实验仪器有限公司，浙江上虞），然后在-20°C保存，直到需要为止。凭证样本（登录号1009015ch）已存放在东北农业大学兽医学院植物标本室。

该标准是从中国药物和生物制品控制研究所（北京，中国）获得的。标准纯度超过98%（w/w）。从杭州试剂公司（杭州，中国）获得甲酸（HPLC级）、乙醇（分析级）和甲醇（HPLC级）。蒸馏水由Milli-Q学术水净化系统（Millipore，Bed ford，MA，USA）净化。

2.2超声波辅助提取生松素

超声辅助提取（UAE）是使用超声装置（Bilon-s650ct）与平尖探针传感器进行的。在整个提取过程中，超声波的频率为30kHz，而探针的功率水平是不同的。提取细胞为棕色玻璃管（直径4cmtimes;7cm高），浸泡在恒温水浴中维持温度。该溶液可用1.25cm探针超声处理，该探针位于提取细胞顶部1cm处。超声装置的关闭时间被认为是气泡的破裂，因此占空比（准时/关闭时间）和总时间分别为1-2s和3s。

探头微尖产生的电声强是按照以下公式^[20]计算的：

其中I是电声强，p是输入功率，r是探针微尖的半径。在该单因素实验中，输入功率电平分别为100、200、300、400、500和600w，分别等于20.4、40.8、61.1、81.5、101.9和122.3w/cm2。

在不同的提取温度（30、40、50、60、70和80°C）、乙醇浓度（0、20、40、60、80和95%）、颗粒直径（lt;；0.15、0.15-0.18、0.18-0.25、0.25-0.36、0.36-0.85和0.85-2m m m）、超声时间（5、15、25、35和45min）、液固比（5、10、15、20、30和25g/l）、电强度（20.4.2）、电强度（82.1）、电强度（121.5）和电强度（121.5）。这些实验一式三份。最后，将提取物在真空下过滤干燥。用HPLC法测定提取物中生松素的浓度。

2.3生松素的回流提取

在超声辅助提取优化的基础上，将提取温度、时间、乙醇浓度、液固比和提取数等参数应用于生松素的回流提取。此外，干燥的雄花序（5.0g）也被处理与其他报告的条件，以确保耗尽的松脆从材料^[21]。提取参数为温度为94.66°C，乙醇浓度为45.92%，液固比为18.55（ml/g），时间为2.27h，提取物在真空条件下干燥。用高效液相色谱法测定了提取物中生松素的含量。

2.4 HPLC分析

用RP-HPLC法测定了实验中的生松素。采用配备lc-10atvp二进制泵的高效液相色谱法、SPD-10avp检测器、CTO-10asv p柱烘箱和N300工作站进行定量分析。采用C18柱（150times;4.6mm，5mu;m，Dimonsil，Dikma技术，中国）进行色谱分离。注射体积为20mu;l，柱温度为25°C。

用流动相acn/H2O（40：60，v/v）在流速为1.0ml/min的条件下对Pinocbrin进行HPLC分离，并在290nm波长下进行检测。注射前用0.45mu;m膜（实验室仪器有限公司）过滤所有溶液。定量采用外部标准方法，采用五点校准曲线..回归方程为y=5times;106x-17309。Pinocbrin的相关系数和线性范围分别为0.9993和872mu;g/ml。

2.5用RSM优化提取条件

在单因素试验结果的基础上，对影响杨树花样品生松素提取工艺的主要实验参数进行了优化，并形成了响应面法。然后，采用包括24个阶乘点和3个轴向点的box-Benken设计来确定最佳提取条件。四个变量（x1，乙醇浓度；x2，提取温度；x3，提取时间；x4，电声强）和三个水平，分别编码高、中、低水平的1、0和-1，如表1所示。

2.6统计分析

所有分析一式三份。采用单向方差分析（ANOVA）对单因素实验数据进行统计分析，然后进行Tukey的后专案检验。spps18.0软件（spss公司，芝加哥，美国）进行数据处理和分析。响应面法的实验设计和统计分析由stat-ease设计专家7.0.0（试用Ver-sion，stat-ease公司，minneanopolis，Mn，美国）软件进行。均值在plt;0.05时有显着性差异。

3结果与讨论

3.1单因素实验分析

3.1.1提取温度的影响

该温度能加速分子运动，降低溶剂的粘度^[22]，因此在30~80°C范围内测试了溶剂的吸附温度。在不同的试验水平（乙醇浓度40%，粒径0.18-0.25mm，提取时间30min，液固比20ml/g，电声强度61.1w/cm2，萃取数1）上，将其他参数设定为常数。图1a显示，随着温度的升高，生松素提取率增加，在60°C的萃取温度下达到峰值提取率（86.28mg/g）。然而，当提取温度高于60°C时，生松素产率下降较小。

图1：不同萃取参数（萃取温度，°C；乙醇浓度，%；颗粒二度计，mm；超声时间，min；液固比，ml/g，电声强，w/cm2）对Pinocbrin萃取率的影响。值表示为平均plusmn;S D（n=3），用单因素法评价。不同字母和同一字母分别具有统计学意义（Plt;；0.05）和统计学意义（Pgt;；0.05）。

提取率随温度的变化可能是由于热和空穴效应的结合所致。从热效应的角度来看，通过细胞壁的扩散和声空化是影响结果的主要因素，提取温度可以显著提高。因此，生松素产率随温度从30°C提高到60°C而增加。由图可知，过热对提取率有负面影响，由于空化效应的降低，气泡中蒸气压的增加会导致超声波^[23,24]的阻碍。Sarat等人报道了在80°C时，生松素的提取率比60°C和100°C的提取率更有效，因为不完全萃取发生在60°C，在100°C时有更多降解^[25]。我们先前的研究还发现，在温度为94.66°C^[21]的条件下，从杨树花中提取总黄酮的产量最高。这些报道表明，生松素具有良好的热稳定性。因此，可以得出结论，生松素产率随温度从60°C提高到80°C而降低不是由于生松素的降解，而是温度的降低。

3.1.2乙醇浓度的影响

根据“类似溶解”的原理，乙醇和水的最佳混合物有利于来自不同草药的黄酮类化合物^[26]。同时，表面张力、粘度和蒸气压等溶剂性能会影响超声辅助萃取过程中的空化效应。原则上，具有较低表面张力和粘度等良好性能的溶剂会产生很大的空化效应^[27]。因此，本实验应对溶剂组成进行测试。如图1b所示，当乙醇浓度从0增加到60%时，生松素产率增加；在此之后，产率显著下降。

结果归因于溶剂极性与空化效应的结合。在极性点上，生松素在60%乙醇中的溶解度高于其他乙醇，从而使生松素在60%乙醇中的提取率达到峰值。在空化效应点，溶剂的表面张力和粘度随乙醇浓度的增加而降低，因此高乙醇容易产生空化效应^[28]。统计分析结果表明，60%乙醇的提取物产率显著高于20%或95%乙醇的提取物产率（Plt;；0.05）（图1b）。然而，40%~80%乙醇提取率无显着性差异（Pgt;；0.05）。

3.1.3粒子直径的影响

为了从草本植物材料中获得最佳的化合物，应测试其粒子直径，因为不同的粒径会显著影响提取率^[29]。在本试验中，采用粒径在0.15~2mm之间的浮法测定粒径对萃取率的影响。图1c显示，生松素的提取率随平均粒径的减小而增加，直到平均粒径为0.18mm。结果表明，由于扩散路径较短，接触面积扩大，较小的尺寸可能导致化合物与植物粉末的分离。已经证实，表面积的增加有利于促进溶剂的进入，降低传质阻力和破坏细胞壁。然而，如果颗粒尺寸太小，扩散是提取的一个难点，这是从天然产物中提取生物活性化合物所不具备的^[30]。从图1c也可以看出，当平均粒径从0.18到0.15mm时，萃取率略有下降。在从国内Cordia^[31]中提取库孜然时，Hadi等人也发现了类似的结果。因此，草药材料的最佳粒径可以提高超声波照射时的转移率。虽然图1c显示颗粒直径对杨树花中生松素的提取率有显著影响（plt;；0.05），但在进一步的RSM实验中没有对其进行评价，因为它不是一个连续变量。因此，在随后的所有试验中都使用了0.18-0.25mm的颗粒直径。

3.1.4超声波时间的影响

一般情况下，由于溶剂和样品接触更充分，时间越长，提取率越高。然而，过长的时间可能会导致较低的过程效率。因此，应该得到一个最佳的提取时间。本试验分析了不同时间（5、15、25、35和45min）超声时间对萃取率的影响，并根据上述结

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