飞扬草新型内生真菌Achaetomium sp.的抗氧化和保肝作用

原文作者 KPG Uma Anitha 单位 VIT University

摘要：目的：从飞扬草中分离出新型内生真菌Achaetomium sp.，再对该新型内生真菌的乙酸乙酯提取物的抗氧化，抗菌，肝脏保护作用进行研究，并测定其总酚含量，类黄酮含量，单宁含量。方法：采用CCl₄诱导的HepG2细胞毒性试验，评价乙酸乙酯提取物的肝保护活性，并进行MTT分析。通过DPPH自由基清除法和扩散试验分别显示其抗氧化能力和抗菌能力。用光谱法测定其总酚含量、单宁含量和类黄酮含量。结果：酚类物质、类黄酮类物质和单宁类物质是乙酸乙酯提取物中存在的植物化学物质，其中含量丰富的酚类物质，具有强效的保肝、抗菌和抗氧化活性。在150ug/mL的浓度下肝细胞存活率的72.13％plusmn;2.948％，而标准水飞蓟素为93.260％plusmn;0.784％。当用不同浓度的乙酸乙酯提取物处理CCl₄暴露的HepG2细胞时，可观察到其试剂依赖性。抗菌活性显示出对金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的显著抑制作用。其抗氧化活性范围为66.890％plusmn;1.385％至87.340％plusmn;0.289％，总酚含量为（44.02plusmn;1.57）ug，类黄酮含量为（54.54plusmn;1.82）ug，单宁含量为（18.790plusmn;1.018）ug。将抗坏血酸，BHT（丁基化羟基甲苯），没食子酸和邻苯三酚作为标准，分别显示出98.370％plusmn;0.763％; 97.080％plusmn;0.636％;94.890％plusmn;1.103％；96.980％plusmn;0.098％的还原电位。结论：结果表明，从飞扬草中分离出的内生真菌产生的代谢产物可能是新型天然产物，且可能导致新药的发现。

关键词：飞扬草；内生；Achaetomium sp. ；保肝；抗氧化剂；抗菌

1、简介

内生菌是存在于植物内的微生物，不会引起植物的任何症状变化，人们不了解这些微生物群落如何影响植物的生理和功能。由于真菌和细菌产生的许多抗生素，微生物产生的次级代谢产物得到了很好的研究，已经测试了由植物内生菌生物合成的代谢物的抗微生物活性。植物的天然产品一直是治疗的重要资源，内生真菌被描述为具有各种应用的各种新型药物化合物的储存室，寄主植物及其内生植物生活在共生或中立的关系中。飞扬草，大戟科，分布于印度各地，也被发现为泛热带杂草。据报道，该植物可用作利尿剂，具有抗炎症，抗痉挛和止泻作用。它用于治疗非洲的呼吸道炎症和哮喘。在马达加斯加，它用于治疗咳嗽、肺病、慢性支气管炎，以及治疗腹泻，特别是阿米巴痢疾。

虽然有更多关于飞扬草的药用用途的信息，但关于与其相关的内生菌的药用性质的报道并不多。因此，从飞扬草分离的内生真菌Achaetomium sp.的研究是在分离、鉴定和评估植物化学、抗氧化、抗微生物和保肝潜力的定量分析的情况下进行的。

2、材料和方法

2.1. 内生真菌的分离

将健康的飞扬草植株小心地连根拔起并带到实验室。用自来水洗涤植物的根以消除土壤和灰尘颗粒，并对其他微生物和样品进行灭菌。将根样切成2mm的片段，并通过依次浸入在4％次氯酸钠1分钟和70％乙醇中2分钟进行表面灭菌，最后用无菌蒸馏水漂洗1分钟。通过压入无菌薄页纸的方法除去水分，然后用该方法确定灭菌的效率。将根外植体转移并浸渍到补充有氯霉素150mg / L的PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基中，置于27℃恒温培育， 并定期观察其真菌生长。最后将来自样品外植体的新出现的真菌小心地转移到具有不含抗生素的PDA的新的培养基中。

2.2. 真菌分离物的显微和分子鉴定

通过显微镜和分子鉴定真菌内生菌。使用试剂盒（Xcelgen，Xcelris实验室，艾哈迈达巴德，印度）分离真菌DNA。使用正向引物（5rsquo;ACCCGCTGAACTTAAGC 3rsquo;）和反向引物（5rsquo;GTCCGTGTTTCAAGACGG 3rsquo;）扩增部分28S rRNA基因。然后将PCR扩增产物在ABI 3730xl遗传分析仪（应用生物系统公司，美国）上进行自动DNA测序。使用对照软件将从正向和反向序列数据产生600bp的28S rRNA的共有序列在基因库中进行对照。且在国家生物技术信息中心（NCBI）进行多次针对该序列的BLASTN搜索。Clustal Omega首先执行多序列比对，并且随后使用trimAI工具对齐文件以进行修剪，并使用MEGA 7.0软件程序使用邻接方法进行系统发育分析。

2.3. 栽培和提取

切下一小片来自真菌菌落的琼脂并接种于300mL的PDB中，在1000mL烧瓶中培养21d。Achaetomium sp.产生了具有红色色素的代谢产物，将马铃薯葡萄糖肉汤变成了红色。将真菌肉汤过滤以分离肉汤和菌丝体。将过滤的肉汤以3600rpm离心10分钟，并用等体积的乙酸乙酯萃取上清液。蒸发有机乙酸乙酯萃取物。将粗提物红色闪亮粉末溶解在DMSO中以测定总酚、单宁、总类黄酮、抗氧化剂、抗菌和保肝潜力。

2.4. 总酚、类黄酮和单宁含量的测定

按照Siddhuraju和Manian的描述，用小的改性方法评估乙酸乙酯提取物中的总酚、类黄酮和单宁含量。用约100mL的乙酸乙酯将Achaetomium sp.的提取物移液到试管中，依次加入900ul 蒸馏水，1mL 1N Folin-ciocalteu酚试剂和2.5mL碳酸钠溶液（20％），在黑暗中温育40分钟，相对于试剂空白，在725nm处记录吸光度的读数。

通过添加具有与单宁结合能力的聚乙烯基聚吡咯烷酮（PVPP）对相同的提取物进行单宁含量的估计。将PVPP（100mg）和1mLdist加入试管中。加入水，然后加入1.0 mL单宁与酚提取物。将试管涡旋并在4℃下温育约4小时。温育后，将样品以3000rpm离心10分钟，收集上清液。因为PVPP使单宁沉淀，所以上清液中只有简单的酚类，没有单宁。如上所述测量具有简单酚类含量的上清液。 通过计算无单宁酚和总酚之间的差异，从而评估总单宁含量。

按照Zhishen等人的方法评价类黄酮含量。取 0.5mL（1mg / mL）的乙酸乙酯提取物和2mLdist，加入水，然后再加入0.15mL 5％NaNO2溶液。6分钟后加入约0.15mL 的10％AlCl3。将混合物静置约6分钟，然后向混合物中加入2mL 4％NaOH溶液。通过加入蒸馏水使最终混合物的体积达到5mL。将混合物充分混合后，再静置15分钟。在510nm处记录吸光度。以水为空白，芦丁用作总类黄酮的定量标准，结果显示为芦丁当量（RE）。

2.5. 抗氧化试验

DPPH测定法已被用于评估Achaetomium sp.菌株的乙酸乙酯提取物的抗氧化能力，且该实验一式三份进行并取其平均值。

2.5.1. DPPH （ 1,1 - 二苯基 - 2 - 苦基肼基）自由基清除活性

通过自由基清除来自Achaetomium sp.的乙酸乙酯提取物，以此测定抗氧化活性。并用Blois描述的方法监测DPPH自由基的光密度变化。分别粗测各个浓度（50,100,125,150,400ug / mL）提取物的抗氧化活性，用甲醇将其体积补足至1mL，然后加入5mL 0.1mM 的DPPH溶液。在室温下，将试管在黑暗中温育20分钟后，在517nm处读取吸光度。计算乙酸乙酯提取物的IC50值。较低的IC50值显示较高的活性。

2.6. 抗菌活性的测定

使用琼脂扩散试验测定其对五种致病性细菌：肺炎克雷伯氏菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性。取100ul培养了24h的测试细菌接种物涂布在Muller Hinton琼脂平板上。无菌条件下在琼脂平板上制备约8mm的孔，将乙酸乙酯提取物以不同的浓度：25ug / mL，50ug / mL，75ug / mL溶解在DMSO中，再滴入至事先制成的8mm直径的孔中。通过测量致病细菌的抑制区域的直径（mm）来评估抗菌活性，并与标准药物氨苄青霉素进行比较。

2.7. Achaetomium sp.乙酸乙酯提取物的体外保肝潜能

标准条件下培养HepG2细胞系。在37℃的5％湿润的CO₂气氛中向细胞补充DMEM和10％胎牛血清。用胰蛋白酶处理细胞，当细胞存活率变为90％时，将细胞接种于96孔微量培养板中，每孔约1.2times;10⁴个细胞。乙酸乙酯提取物的HepG2细胞的保肝潜力如下。将正常HepG2细胞与DMEM一起温育并补充10％胎牛血清12小时。对于正常对照，仅用 DMEM和DMSO v / v 处理细胞。然后将细胞在分别含有浓度为12.5、25、50、75、100、150ug / mL的乙酸乙酯提取物的DMEM中孵育12小时，并用1％CCl₄处理1.5小时。对于标准，将细胞在分别含有浓度为12.5、25、50、75、100、150ug / mL水飞蓟素的培养基中持续培养12h，然后用1％CCL₄处理1.5小时。每个试验测定一式三份进行，并使用具有轻微修饰的MTT测定评估细胞活力。比色测定涉及线粒体琥珀酸脱氢酶，它只存在于活细胞中，它在将MTT转化为紫色甲衍生物中起作用。以乙酸乙酯提取物为样品，水飞蓟素为标准品，样品和标准样品均以CCl₄为毒性剂。然后除去培养基，加入100uL含MTT 10uL（0.5mg / mL）的新鲜培养基，将细胞培养2小时，加入100uL DMSO溶解紫色甲衍生物晶体，在570nm处读取吸光度。

通过以下公式计算细胞存活百分比

式：

细胞存活率%=（测试组吸光度值/对照组吸光度值）*100%

细胞毒性%=1-细胞存活率%

2.8. 统计分析

数值表示为三次重复实验测定的平均值plusmn;标准偏差，通过方差分析（ANOVA）并随后进行Duncan检验来进行统计学分析。与使用SPSS（版本13.0）的对照组相比，P lt;0.05被认为是显着的指示。

3. 结果

3.1. 真菌分离物的显微和分子鉴定

从飞扬草中分离出的真菌菌落，在显微镜检查和分子鉴定的基础上，确定该分离物属于Achaetomium属。从系统发育树中可以明显看出，该分离物与Achaetomium strumarium（A. strumarium）（JX863914）具有最大的同源性。最佳BLAST匹配为内生真菌Achaetomium sp.，与其具有最大的同源性。在28S rRNA基因同源性的基础上，将真菌的分离物命名为Achaetomium sp.，并将28S rRNA基因序列提交至GenBank，登录号为KY231923（Achaetomium sp.）

3.2. Achaetomium sp .乙酸乙酯提取物中总酚，单宁和类黄酮含量的测定

总酚和单宁含量以没食子酸当量表示，总类黄酮含量以芦丁当量表示。250ug / mL菌株Achaetomium sp.的乙酸乙酯提取物中，估计总酚含量为（44.02plusmn;1.57）ug; 发现总类黄酮含量为（54.540plusmn;1.820 ）ug，总单宁含量为（18.790plusmn;1.018）ug。试验一式三份进行测定，取平均值，结果显示在没食子酸当量（GAE）中， 酚类和类黄酮含量都有助于提高其抗氧化能力。

3.3. 抗氧化试验（DPPH 法 ）

抗氧化活性被视为颜色从紫色到黄色的变化，Achaetomium sp.的乙酸乙酯提取物显示出显著的抗氧化活性。发现浓度为50,100,150和500ug / mL的乙酸乙酯提取物的抑制率分别为66.89％plusmn;1.385％; 71.43％plusmn;1.414％; 79.10％plusmn;1.081％和87.34％plusmn;0.289％。Achaetomium sp.的乙酸乙酯提取物的抗氧化能力可用丁基化羟基甲苯（BHT），抗坏血酸（AA），没食子酸（GA）和邻苯三酚（PG）进行参考比对。在DPPH自由基清除试验中，发现 Achaetomium sp.提取物的IC50值为32.26ug/mL。

3.4. 抗菌活性

针对五种细菌菌株评价了Achaetomium sp.的乙酸乙酯提取物的体外抗菌活性。金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌，分别都具有三种不同浓度25ug/mL、50ug/mL 和75ug/mL。乙酸乙酯提取物对其显示出显著的抗菌活性，最大抑制区域直径为22毫米，最小抑制区域直径为17毫米。其中对金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌具有显着的抗菌作用，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有中等作用。乙酸乙酯提取物对五种致病菌的光谱活性是显着的。在低浓度25ug / mL时，没有针对任何细菌病原体的活性。但在50ug/mL的浓度下，对肺炎克雷伯菌（18毫米），枯草芽孢杆菌（18毫米）和铜绿假单胞菌（18毫米）以及中等活性大肠杆菌（14毫米），金黄色葡萄球菌（13毫米）具有显着的抑制活性。但在浓度为75ug/mL时，对金黄色葡萄球菌（22 mm），肺炎克雷伯菌（22 mm），铜绿假单胞菌（22 mm），大肠杆菌（18 mm）和枯草芽孢杆菌（18毫米）的抑制作用更强。结果与氨苄青霉素作为标准的药物抗菌活性相当。

3.5. 肝脏保护作用

用肝

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