一氧化氮对蘑菇的酚类和黄酮类物质的含量的影响和抗氧化活性研究

摘要：本文研究了一氧化氮（NO）对蘑菇(正红菇)抗氧化活性及酚类物质和黄酮类化合物含量的影响。将新鲜收获的蘑菇在20℃下用0,10,20和30mu;L/L的NO熏蒸2小时，然后采用以下方法检测其抗氧化活性：还原力法，对亚铁离子的螯合作用，对羟基自由基的清除作用和2,2-二苯基-1-苦基肼自由基清除活性。结果表明，与对照相比，用NO熏蒸的蘑菇的抗氧化活性显着增加。此外，NO熏蒸显着提高了酚类和黄酮类物质的含量，并刺激了苯丙氨酸解氨酶和查耳酮合酶的活性。结果表明，NO熏蒸可能有潜力应用于增强蘑菇中的生物活性化合物和提高抗氧化活性。此外，数据表明NO诱导的酚类和黄酮类物质积累是由于蘑菇中生物合成途径的激活所致。

关键词：蘑菇（正红菇）;一氧化氮熏蒸;抗氧化活性;黄酮类化合物;酚类

1. 介绍

摄入含有抗氧化性的植物性食品可以帮助预防各种疾病，如癌症，心脑血管疾病和神经退行性疾病（Aquilano, Baldelli，Rotilio和Ciriolo，2008; Halliwell＆Gutteride，1984）。 这种保护主要与植物性食物中的抗氧化剂清除自由基的能力有关，而自由基就是造成脂质，蛋白质和核酸氧化损伤的原因（Bimla＆Punita，2006）。 植物化学物质，例如水果和蔬菜中的酚类和黄酮类物质，被认为是对健康有利的主要生物活性化合物之一（Mallavadhani et al., 2006).

蘑菇在中国和其他国家颇受欢迎并长期被食用，并且在我们的饮食中越来越重要。因为它们的营养价值丰富，具有高蛋白质和低脂肪、能量含量低的特征（Mattila，Suonpauml;auml; amp; Piironen，2000）。蘑菇会积累多种次生代谢产物，包括酚类化合物，聚酮化合物，萜类，类固醇等。(Kim et al., 2008)。 最近，蘑菇作为功能性食品和作为对人体生理上有益的药物的来源，备受人们的喜爱，而且食用蘑菇并没有不良副作用（Kim et al., 2008）。 蘑菇的许多生物学功能，如抗癌，抗病毒，增强免疫力和降低血脂活性，奏效的原因是其具有自由基清除能力和抗氧化活性。因此，研究具有抗氧化活性的次生代谢产物，如蘑菇中的酚类和黄酮类物质，作为潜在的保护剂，对于帮助人类健康具有很大的发展前景。

数据表明，植物中次生代谢产物的生物合成和积累是由内源信号系统介导的，其中，据报导，一氧化氮(NO)起至关重要的作用（Hahlbrock et al., 2003; Xu, 2007）。据大量报导，NO参与介导了UV-B诱导的白桦叶片中的黄酮类物质的积累(Zhang, Dong,Jin, Sun, amp; Xu, 2011)；在贯叶金丝桃悬浮细胞中真菌激发剂中诱导了金丝桃素的生物合成（Xu, Dong, amp; Zhu, 2005a）；在茉莉酸甲酯诱导的红豆杉细胞悬浮培养物促进产生了次生代谢物（Wang amp; Wu, 2005）；促进了臭氧的诱导银杏醇细胞产生银杏醇（Xu et al., 2011）。在以前的研究中，我们报道了外源性应用NO在长春花悬浮细胞中刺激长春质碱生物合成（Xu, Dong, amp; Zhu, 2005b）。 这些结果表明，NO可能是诱导植物细胞中次生代谢物积累的有效诱导因子。然而，关于NO对蘑菇中抗氧化剂化合物积累的影响的研究微乎其微。

本实验的目的是研究一氧化氮对蘑菇（正红菇）的酚类和黄酮类物质含量以及抗氧化活性的影响。结果表明，对于采摘后的蘑菇来说，NO显着提高了酚类和黄酮类物质的含量，并刺激了蘑菇的抗氧化活性。此外，数据表明，NO诱导的次生化合物积累可能是由蘑菇中生物合成途径激活的。

2. 材料和方法

2.1. 植物材料和NO熏蒸

本次实验的原材料——蘑菇（R. griseocarnosa），产自中国浙江杭州的一个农场，于2010年9月收获，收获后立即运送到实验室。然后选取大小均匀，成熟均匀且无肉眼瑕疵的750株均质蘑菇，采用10个蘑菇3个重复样品测定收获时的特性，然后将剩下的720个蘑菇随机分为四个批次用于以下处理：对照（不处理）和10,20和30mu;L/L浓度下的NO处理。通过熏蒸对蘑菇进行处理，在环境温度（20℃）下，在不同浓度的NO（10,20和30mu;L/L）的密封塑料容器（50L）中放置2小时。 不同浓度的NO是从装有4500mu;L/L 的氮气瓶（杭州新世纪混合气体有限公司，中国）通过50ml的注射器由容器盖上的注射口获得的。处理后，将对照和处理过的蘑菇分成样品，每个样品由10个蘑菇组成，并在20℃或约20℃的条件下储存。95％的相对湿度在温度控制室储存6天。 储存期间，每天随机抽取3个蘑菇样品，分别测量抗氧化活性和酚类、类黄酮的含量。

2.2. 蘑菇甲醇提取物的制备

收集通过不同处理的蘑菇的果实体，并除去残留的堆肥/土壤，随后在中心温度为55℃的烘箱空气干燥至恒重（5小时）。 将所有干燥的蘑菇研磨成粉末状并过40目筛。 将每一克干蘑菇样品与30ml甲醇混合。 将样品搅拌1小时进行有效提取，并以2000xg离心15分钟。 将上清液（甲醇提取物）在4℃下储存直至完成抗氧化活性和总黄酮、总酚的含量分析。

2.3. 测定抗氧化活性

2.3.1. 还原力的测定

还原力的测定方法是在Oyaizu（1986）的方法基础上稍作修改。小心地将2.5ml蘑菇甲醇提取物与2.5ml 200mM磷酸钠缓冲液（pH6.6）和2.5ml 1％铁氰化钾溶液混合。混合物在50℃温育20分钟后，加入2.5ml 10％三氯乙酸（TCA）（w / v），再将混合物在2000g下离心10分钟。将 上清液（5ml）与5ml去离子水和1ml 0.1％氯化铁混合，用分光光度计在700nm处测量吸光度。以BHT和抗坏血酸为标准。吸光值越高，还原力越强。

2.3.2. DPPH·自由基清除试验

不同处理的蘑菇清除2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH·）自由基的能力为根据所报导的方法(Hatano, Kagawa,Yasuhara, amp; Okuda, 1988）进行稍作修改。即将0.3ml蘑菇的甲醇提取物与2.7ml含有DPPH自由基的甲醇溶液（6mu;mol/l）混合。剧烈振摇混合物并在黑暗处放置60分钟，直到获得稳定的吸收值为止。通过连续监测517nm处的吸收峰的减少量来测量DPPH自由基的清除率。 使用以下等式计算自由基清除活性（RSA）作为DPPH变色的百分比：RSA（％）= 100(1 -A_C/A_D),其中A_C是蘑菇甲醇提取物溶液的吸光度，A_D是DPPH溶液的吸光度。

2.3.3. 清除羟基自由基的作用

OH通过芬顿反应产生的，并通过其对水杨酸的能力来检测，如Smirnoff and Cumbes(1989)所描述的。总体积为4ml的反应混合物包含有：的9mM FeSO ₄（1ml），9mmol / l水杨酸（1ml），8.8mmol / l H₂O₂（1ml）和1ml蘑菇甲醇提取物。用1ml甲醇代替样品作为对照，用分光光度法在510nm处测量吸光度。

2.3.4. 亚铁离子的螯合作用

在Decker and Welch (1990)的方法基础上稍作修改，检测蘑菇中亚铁离子的螯合效应。即将0.5ml蘑菇甲醇提取物与0.05ml 2mmol/l FeCl₂以及0.2ml 5mmol /l ferrozine试剂混合。用甲醇稀释至总体积2ml。然后，剧烈振摇混合物并在室温下放置10分钟。混合物达到平衡后，用562nm分光光度法测定溶液的吸光度。使用以下公式计算抑制Ferrozine-Fe² 复合物形成的百分比：螯合效率（%）=[ (A_处理-A_样品)/A_处理]times;100，其中A_处理是ferrozine-Fe² 复合物的吸光度，A_样品是蘑菇提取物的吸光度。以BHT和TBHQ作标准。

2.4. 总酚类物质的测量

采用福林酚法(Folin amp; Ciocalteu, 1927)测定蘑菇的总酚含量(在Singleton, Orthofer, and Lamuela-Raventos (1999)基础上有所修改)。为了制备校准曲线，将1ml等分试样的0.024,0.048,0.072,0.096,0.12分别和

0.144mg / ml甲醇五倍子溶液与5ml Folin-Ciocalteu试剂和4ml碳酸钠（75g /l）均匀混合。在20℃下放置1小时后，测量在765nm处的吸光度并绘制标准曲线。 向相同的试剂（Folin-Ciocalteu试剂和碳酸钠）中，如上所述混合1ml甲醇蘑菇提取物，1小时后测量765nm处的吸光度。 蘑菇中的总酚含量表示为每克样品中的没食子酸当量毫克数。

2.5. 总黄酮含量的测定

黄酮类物质以芦丁为等价物。以芦丁来制作标准曲线（0.012，0.024，0.048，0.072，0.096mg/ml，以70％乙醇做溶剂（v/v））。测定总黄酮含量的方是在Lin and Tang (2007)所描述的方法上稍作修改。即标准溶液或提取物（1ml）与0.3ml 5％NaNO₂（w/v）混合.6分钟后,将0.1ml的10％Al（NO₃）₃（w /v）混合后再静置6分钟。然后，加入4ml的4％NaOH，用70％乙醇（v/v）稀释至10ml。静置12分钟后，测量反应混合物在510nm处的吸光度。总黄酮含量表示为每克提取物的芦丁当量毫克数。

2.6. PAL和CHS活性的测定

苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性的检测方案按照报道的方法测定(Tanak, Kojima, amp; Uritani, 1974）。将五克新鲜样品在20ml硼酸钾中均质化，其中含有5mmol/l beta;-巯基乙醇和2mmol/l EDTA的高速缓冲液（0.1mol/l，pH8.0）。将匀浆用2000xg离心20分钟，收集上清液进行酶分析。为了确定PAL活性，将0.5ml上清液在30℃下，在2ml含有1ml L-苯丙氨酸（0.1mmol/l,预溶解的）的0.1mol/l硼酸盐缓冲液（pH8.0）中温育1小时在pH8.8的0.01mol/l硼酸盐缓冲液中。测量由于形成反式肉桂酸酯而引起的OD_290nm的光度增加。PAL活性表示为OD_290nm的h^-1mg^-1蛋白质的变化。蛋白质用通过染料结合法Bradford(1975)测定的牛血清白蛋白作为标准物。

查耳酮合酶（CHS）活性的测量方法按照Kreuzaler and Hahlbrock (1975)报道的方法稍作修改测量。即，将0.08ml酶提取物在30℃下预温育1分钟，然后用0.02ml CoA-混合物处理，并在30℃温育5分钟。CoA-混合物是由50mu;mol /l对香豆酰基-CoA与42.5mu;mol/l[2-¹⁴C]-丙二酰-CoA（14.7mu;Ci/mu;mol）混合并将其pH 用KOH调节至8.0，然后再加入酶提取物而成。这个反应是通过加入含有5mu;g柚皮素的0.2ml乙酸乙酯终止的，混合然后离心（12,000xg，10分钟，25℃）。收集有机层（150mu;l）并蒸发。将残余物溶于10mu;l乙酸乙酯中并点在Avicelcellulose薄层色谱板上。薄层色谱法是使用5％2,5-二苯基恶唑和0.025％1,4-双[2-（4-甲基-5-苯基恶唑基）]苯进行。放射性用液体闪烁计数器XH27-FJ-2017P（ZHONGTAI Instruments，Beijing）测量。CHS活性表示为pkat mg^-1蛋白质。蛋白质用通过Bradford, 1976的染料结合法测定的牛血清白蛋白作为标准物。

2.7. 统计

实验使用完全随机化的设计进行。来自实验的数据通过简单的t检验进行分析，以在同一时间点进行的每种处理和其对照之间的简单比较以及用于均值之间的多重比较的Tukey检验。 方差分析的假设在P lt;0.05时被认为是统计显着的。

3. 结果与讨论

3.1. NO熏蒸增强了蘑菇中酚类和黄酮类物质的含量

黄酮类和酚类物质被认为是有益的抗氧化剂，因为它们表现出有害活性氧的清除活性（Wootton-Beard＆Ryan，2011）。NO对蘑菇中酚类和黄酮类物质的含量的影响已在本文中进行了研究。 如图.1所示，NO处理后3 d蘑菇中酚类物质和黄酮类物质含量均显着增加（P lt;0.05），而未处理NO处理的香菇中酚类

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